人体结缔组织在自然衰老过程中按一定的模式发生进行性自然交联,分子间和分子内的交联在多种生物过程中具有重要作用。胶原交联也可通过不同的方法进行诱导,如非酶糖基化、有或无光敏剂的紫外线照射以及醛反应等。交联技术现已被广泛应用于医学领域,如生物医学材料的制备、角膜的交联等。其中,核黄素/紫外线A诱导的角膜交联术(corneal crosslinking,CXL)可提高角膜的生物力学强度,最初在临床上用于治疗进展期圆锥角膜。圆锥角膜是一种以角膜中央或旁中央局限性变薄并突起呈圆锥样为特征的非炎症性疾病。本病好发于青春期,可导致严重的不规则角膜散光和高度近视,视力严重下降,并且佩戴框架眼镜矫正效果欠佳,晚期发生急性圆锥角膜后可因上皮下白色瘢痕形成而造成严重的视力损害,对患者的生活质量产生相当大的影响。现今在临床上有很多种治疗圆锥角膜的方法,如佩戴硬性角膜接触镜、角膜交联术、角膜基质环植入术、板层或穿透性角膜移植术等,其中角膜交联术是目前唯一微创且有效的阻止圆锥角膜病情进展的手术方法。Sporl等在1997年首次提出CXL可以改变角膜的生物力学性能,从而为圆锥角膜的保守治疗提供了一种选择。Wollensak等在2003年首次发表了 CXL治疗圆锥角膜的临床报道,提出此疗法不但可以有效的阻止圆锥角膜的扩张,减少圆锥角膜患者对穿透性角膜移植术的需求,而且还具有创伤小、治疗简单、相对安全等特点。为了缩短CXL的治疗时间,减少CXL术中及术后并发症,提高患者的舒适度等,临床上相继出现了快速CXL、经上皮CXL等一些改进的交联模式,但就其是否能够达到与传统CXL同等的手术效果,目前仍存在着很多争议。所以传统CXL仍被很多临床医生视为最佳的交联模式,并且在临床上广泛应用的10多年中,对圆锥角膜患者的治疗取得了非常好的效果。然而,在实际临床工作中,我们会发现部分圆锥角膜患者经过传统CXL治疗后,病情仍然无法得到有效的控制。CXL是利用370 nm紫外线A(ultraviolet-A,UVA)和光敏剂核黄素来诱导角膜基质胶原纤维之间产生新的连接,从而改善角膜生物力学性能的方法。除UVA和光敏剂核黄素外,有效的交联还需要氧气的存在。有氧环境中,UVA和核黄素之间的相互作用产生以单线态氧为主活性氧族(ROS),进一步激活正常的赖氨酰氧化酶途径,从而使胶原分子和其他糖蛋白分子之间以及胶原纤维之间形成新的共价连接。而CXL中,尤其是在交联的前期,角膜中的氧气消耗非常迅速,恢复却非常缓慢,所以常规条件下的角膜交联反应中,氧气可能是限制交联效果的关键性因素。因而我们推测术中给予充足的氧气或许会提高CXL的效果,并可适用于常规条件下传统CXL无法控制病情进展的圆锥角膜患者。本次研究的第一部分是动物实验研究,通过对高浓度氧条件下传统CXL术后猪眼角膜基质的杨氏模量的检测,来探讨高浓度氧对CXL术后角膜生物力学强度的影响。本次研究的第二步部分是前瞻性随机对照临床研究,通过评估高浓度氧条件下传统CXL治疗进展期圆锥角膜的有效性及安全性,探讨高浓度氧对传统CXL治疗进展期圆锥角膜效果的影响以及高浓度氧条件下CXL临床应用的可行性。第一部分高浓度氧条件下传统角膜交联术后的角膜生物力学分析目的通过对常规条件下传统角膜交联与高浓度氧条件下传统角膜交联术后角膜生物力学变化的比较,评估高浓度氧对角膜交联效果的影响。方法本实验采用分组对照的方法。取新鲜离体猪眼60只,随机分成3组,每组20只。第1组为对照组,仅去除中央直径9mm区域角膜上皮;第2组在常规条件下接受传统CXL;第3组在高浓度氧条件下接受传统CXL。1.角膜交联方法:机械刮除中央直径9mm的角膜上皮,0.1%等渗核黄素溶液滴眼,频率为3分钟/次,共30分钟。确认前房出现黄染后,UVA(370 nm,3mW/cm2)距离为5mm垂直照射角膜30分钟。在UVA照射过程中,5分钟/次继续0.1%等渗核黄素溶液滴眼。在第3组UVA照射过程中,还需向角膜持续输送湿润的纯氧(4 L/min),只有在滴用核黄素溶液时,暂停约20秒供氧。为了使角膜周围保持相对恒定的氧气浓度,我们在角膜上方安放了一个倒置的负压吸引环,使角膜保持在一个相对密闭的腔室,纯氧通过连接管道输送到角膜中央区域。2.角膜生物力学测试:从角膜中的12点至6点钟方向提取约5×14mm的角巩膜测试条带,每条带两端约有1mm巩膜组织。将测试条带垂直夹在INSTRON试验机的两个夹头上,距离为8-10mm。每个测试条带加载-卸载7次循环后,以2mm/min的速率逐渐增加负荷,直到条带被拉断破裂。应力(σ)的值通过公式σ=F/5t获得,其中t是角膜厚度。应变(ε)值由方程ε=Δ L/L0得出。杨氏模量(E)采用方程E=d σ/dε,即4%,6%,和8%应变时的应力-应变曲线斜率值。3.交联前后的角膜厚度值采用超声角膜测厚仪测量获取。结果1.去上皮后,1、2、3组的中央角膜厚度(central comeal thickness,CCT)分别为771±55μm、780±70μm和804±66μm。CXL后,第2组和第3组CCT分别为749±67μm和764±63μm。2、3组CXL后的CCT与CXL前比较差异均无统计学差异(P>0.05)。2.在4%应变条件下,1、2、3组角膜的杨氏模量分别为:0.68±0.20 MPa、1.01±0.23 MPa和1.12±0.24 MPa。第2组和第3组角膜的杨氏模量比较,差异无统计学意义(P>0.05),但第2组和第3组角膜的杨氏模量均显著高于第1组(P<0.05)。3.在6%应变条件下,1、2、3组角膜的杨氏模量分别为:0.97±0.21 MPa、1.35±0.25 MPa、1.64±0.44 MPa;在8%应变条件下,角膜的杨氏模量分别为:1.29±0.26 MPa、1.72±0.45 MPa、2.20±0.74 MPa。在6%和8%应变条件下,第2组和第3组角膜的杨氏模量均显著高于第1组(P<0.05),并且第3组角膜的杨氏模量显著高于第2组(P<0.05)。结论1.在UVA照射过程中增加角膜周围氧浓度可以提高传统CXL术后的角膜生物力学强度。2.本实验的结果值得进一步研究,尤其是在常规条件下传统CXL手术效果不佳的患者中的临床应用。第二部分 高浓度氧条件下传统角膜交联治疗进展期圆锥角膜的临床研究目的观察高浓度氧条件下传统角膜交联治疗进展期圆锥角膜的的临床效果,评价其有效性、安全性以及对术后视觉质量的影响。方法本研究为前瞻性随机对照,共纳入22例进展期圆锥角膜患者,共30只眼。将30只眼随机分为两组,每组15只眼。第1组患者在常规条件下接受传统CXL治疗,第2组患者在高浓度氧条件下接受传统CXL治疗。角膜交联方法:表面麻醉后,用刮刀刮除中央直径9mm区域的角膜上皮。0.1%等渗核黄素(最薄角膜厚度(thinnest corneal thickness,TCT)>400μm)或0.1%低渗核黄素(TCT<400μm)3分钟/次持续滴眼30分钟。使用带钴蓝滤光片的裂隙灯来确认前房是否存在核黄素,并行光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)检查角膜厚度,保证角膜厚度达到400μm以上。UVA(370 nm,3mW/cm2)距离为5mm垂直照射角膜30分钟。在UVA照射期间,继续每5分钟一次核黄素溶液滴眼。在UVA照射期间,向第2组角膜持续供给湿润的纯氧(4 L/min),只在滴用核黄素溶液时,暂停约20秒。我们在角膜上方安放了一个倒置的负压吸引环,来使其处在一个相对密闭的腔室,来保持恒定的氧气浓度。纯氧通过连接管道输送到角膜中央区域。术前及术后3、6个月记录患者的裸眼视力(uncorrected visual acuity,UCVA)、最佳矫正视力(best corrected visual acuity,BCVA)、最大角膜曲率(maximum keratometry,Kmax)、平均角膜曲率(mean keratometry,Kmean)、TCT和角膜内皮细胞密度(endothelial cell density,ECD),并进行评估。结果1.第2组中1例患者(1只眼)因术后未曾来我院复查,缺乏随访数据而被排除。故本研究共21例患者29只眼纳入统计分析。两组患者术后角膜上皮均愈合良好,术后均未见严重并发症。2.两组患者术后6个月的UCVA(LogMAR)与术前比较均有明显的提高(P<0.05)。3.两组患者术后6个月的Kmax与术前比较均明显下降(P<0.05)。两组患者术后3、6个月Kmean均有降低,第1组患者术后3、6个月Kmean与术前比较,差异均无统计学意义(P>0.05),而第2组患者术后6个月的Kmean明显低于术前(P<0.05)。4.两组患者术后3、6个月的TCT及ECD与术前比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。5.两组患者术后 3、6 个月的 Kmax、Kmean、UCVA、BCVA、TCT 及 ECD变化量的比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:1.高浓度氧条件下的传统CXL为是一种安全的手术方式,并且可以更为有效阻止圆锥角膜的进展。2.我们的结果为进一步研究高浓度氧条件下的传统CXL在对常规CXL治疗效果不佳的患者中的应用提供了基础。