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乳酸菌等非芽孢益生菌耐热性差，货架期短，是益生菌行业亟待解决的关键问题。本文以张氏副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei Zhang)为研究对象，从固态发酵和液态发酵抗逆性差异为切入点，对比分析了两种不同发酵方式在菌体结构、生理变化、代谢过程、基因表达等方面的差异，初步揭示了副干酪乳杆菌抗逆机理。主要的研究结果如下：
1.固态发酵张氏副干酪乳杆菌相比液体发酵具有更好的抗逆性。固态发酵的菌体经冷风干燥后存活率为32.93%，显著高于液态发酵菌体22.13%的存活率；固态发酵菌体经喷雾干燥后的存活率为0.21%，显著高于液态发酵菌体0.15%的存活率。
2.研究确定了张氏副干酪乳杆菌产生明显变化的胁迫的条件，分别为58℃、0.6%过氧化氢、30%乙醇、pH2,处理10min。对比了固态发酵和液态发酵菌体抗逆性的差异：采用上述胁迫条件，固态发酵的菌体存活率是液态发酵菌体的3.57倍(热胁迫)、2.6倍(过氧化氢胁迫)、3.22倍(乙醇胁迫)；液态发酵的菌体存活率是固态发酵菌体存活率的46.07倍(酸胁迫)。
3.胁迫处理后，固体培养菌体膜结构保持完整、胞内pH值和酶活性稳定。热胁迫和乙醇胁迫后，固态发酵的菌体细胞膜不饱和程度轻度下降，膜壁结构基本完好，膜流动性保持不变，液态发酵的菌体则出现明显下降。经热胁迫和乙醇胁迫后，固态发酵的菌体细胞内pH下降不明显，液态发酵的菌体下降显著；固态发酵菌体胞内ATP酶活力、谷胱甘肽还原酶活力和丙酮酸激酶活力等高于液态发酵的菌体。
4.转录组分析发现，固态发酵菌体中与碳水化合物转运、糖酵解和糖异生途径、磷酸戊糖途径、磷酸肌醇代谢途径、丙酮酸代谢、部分与环境适应相关的基因得到上调表达，脂肪酸合成的相关基因下调表达。
5.根据转录组结果，开发利用内源性CRISPR-Cas9基因编辑方法，进行了33个相关基因的敲除，发现glpF基因和glpO基因与张氏副干酪乳杆菌的抗逆性和生长相关。glpF基因和glpO基因的敲除株与野生株相比，热胁迫后存活率分别下降了83.67%和78.52%，经氧化胁迫后存活率分别下降了87.75%和98.96%。glpK基因仅与生长相关，glpK基因的敲除株与野生株相比，菌数下降了24.80%。
6.依据转录组数据和分子实验结果发现，培养基中添加特定种类和比例的碳源可以提高张氏副干酪乳杆菌的抗逆性和生长性能。经甘油替换培养得到的菌体耐热性(58℃处理10min)和耐氧化性(0.6%的H2O2溶液处理10min)都较原始培养基培养的菌体有明显提高，在添加20g/L的甘油培养时，菌体耐热性较原始增加了1304%，菌体耐氧化性较原始增加了809%，但此时菌数却较原始低一个数量级。纤维二糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、果糖等替换葡萄糖培养，菌体的耐热性较原始都显著下降，但菌数明显高于原始组。组合实验中，以甘露糖和甘油按1∶3的比例下，菌体耐热性较原始提高了165%，耐氧化性较原始提高了75%，菌数较原始提高了67%。添加特定种类的糖类(甘露糖、纤维二糖、葡萄糖、柠檬酸和果糖)能够显著提高固态发酵的总菌数(总菌数分别为：3.46×1011CFU、3.6×1011CFU、3.4×1011CFU、3.81×1011CFU和3.77×1011CFU，相较于对照分别提高了40.08%、45.75%、37.65%、54.25%、52.63%)。改变培养方式可以改变菌体的抗逆性，振荡培养菌体耐热性和耐氧化性分别是静置培养菌体的1.23倍和24.83倍。
本文从张氏副干酪乳杆菌固态和液体发酵菌体存在明显抗逆差异这一现象入手，从表型、结构、转录组和基因等多层次开展了系统分析研究，发现物质吸收转运，产能代谢的强度和还原力形成等都与菌体的抗逆性有关。相关基因的敲除和碳源替换试验验证了上述结论。本文的研究丰富了对乳酸菌抗逆机理的认识，为乳酸菌抗逆性的提高提供了新的方法和参考。
1.固态发酵张氏副干酪乳杆菌相比液体发酵具有更好的抗逆性。固态发酵的菌体经冷风干燥后存活率为32.93%，显著高于液态发酵菌体22.13%的存活率；固态发酵菌体经喷雾干燥后的存活率为0.21%，显著高于液态发酵菌体0.15%的存活率。
2.研究确定了张氏副干酪乳杆菌产生明显变化的胁迫的条件，分别为58℃、0.6%过氧化氢、30%乙醇、pH2,处理10min。对比了固态发酵和液态发酵菌体抗逆性的差异：采用上述胁迫条件，固态发酵的菌体存活率是液态发酵菌体的3.57倍(热胁迫)、2.6倍(过氧化氢胁迫)、3.22倍(乙醇胁迫)；液态发酵的菌体存活率是固态发酵菌体存活率的46.07倍(酸胁迫)。
3.胁迫处理后，固体培养菌体膜结构保持完整、胞内pH值和酶活性稳定。热胁迫和乙醇胁迫后，固态发酵的菌体细胞膜不饱和程度轻度下降，膜壁结构基本完好，膜流动性保持不变，液态发酵的菌体则出现明显下降。经热胁迫和乙醇胁迫后，固态发酵的菌体细胞内pH下降不明显，液态发酵的菌体下降显著；固态发酵菌体胞内ATP酶活力、谷胱甘肽还原酶活力和丙酮酸激酶活力等高于液态发酵的菌体。
4.转录组分析发现，固态发酵菌体中与碳水化合物转运、糖酵解和糖异生途径、磷酸戊糖途径、磷酸肌醇代谢途径、丙酮酸代谢、部分与环境适应相关的基因得到上调表达，脂肪酸合成的相关基因下调表达。
5.根据转录组结果，开发利用内源性CRISPR-Cas9基因编辑方法，进行了33个相关基因的敲除，发现glpF基因和glpO基因与张氏副干酪乳杆菌的抗逆性和生长相关。glpF基因和glpO基因的敲除株与野生株相比，热胁迫后存活率分别下降了83.67%和78.52%，经氧化胁迫后存活率分别下降了87.75%和98.96%。glpK基因仅与生长相关，glpK基因的敲除株与野生株相比，菌数下降了24.80%。
6.依据转录组数据和分子实验结果发现，培养基中添加特定种类和比例的碳源可以提高张氏副干酪乳杆菌的抗逆性和生长性能。经甘油替换培养得到的菌体耐热性(58℃处理10min)和耐氧化性(0.6%的H2O2溶液处理10min)都较原始培养基培养的菌体有明显提高，在添加20g/L的甘油培养时，菌体耐热性较原始增加了1304%，菌体耐氧化性较原始增加了809%，但此时菌数却较原始低一个数量级。纤维二糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、果糖等替换葡萄糖培养，菌体的耐热性较原始都显著下降，但菌数明显高于原始组。组合实验中，以甘露糖和甘油按1∶3的比例下，菌体耐热性较原始提高了165%，耐氧化性较原始提高了75%，菌数较原始提高了67%。添加特定种类的糖类(甘露糖、纤维二糖、葡萄糖、柠檬酸和果糖)能够显著提高固态发酵的总菌数(总菌数分别为：3.46×1011CFU、3.6×1011CFU、3.4×1011CFU、3.81×1011CFU和3.77×1011CFU，相较于对照分别提高了40.08%、45.75%、37.65%、54.25%、52.63%)。改变培养方式可以改变菌体的抗逆性，振荡培养菌体耐热性和耐氧化性分别是静置培养菌体的1.23倍和24.83倍。
本文从张氏副干酪乳杆菌固态和液体发酵菌体存在明显抗逆差异这一现象入手，从表型、结构、转录组和基因等多层次开展了系统分析研究，发现物质吸收转运，产能代谢的强度和还原力形成等都与菌体的抗逆性有关。相关基因的敲除和碳源替换试验验证了上述结论。本文的研究丰富了对乳酸菌抗逆机理的认识，为乳酸菌抗逆性的提高提供了新的方法和参考。