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目的分析猬迭宫绦虫27kDa半胱氨酸蛋白酶(Cysteine protease,CP)分子生物学特性,了解其在猬迭宫绦虫成虫和裂头蚴不同部位及裂头蚴不同感染时期的表达模式。方法1.猬迭宫绦虫27kDa CP的编码cDNA序列分析及克隆、表达。(1)运用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(Ex PASy)和美国国家生物技术信息中心(NCBI)等有关的生物信息学分析工具,预测和分析猬迭宫绦虫CP的结构与生物学功能。(2)构建猬迭宫绦虫CP基因原核表达重组质粒pET-28a(+)-SEP-CP,并在大肠杆菌Transetta(DE3)中诱导表达,对所获重组蛋白进行SDS-PAGE分析。2.裂头蚴CP基因时空表达模式的检查。(1)收集安顺地区野生王锦蛇体内猬迭宫绦虫裂头蚴。将64只昆明小鼠随机分成8组,每组8只,以5条裂头蚴/只感染小鼠,于感染后30 min~14 d各剖杀1组小鼠,收集感染小鼠体内的裂头蚴。(2)以10条/只感染3只幼犬,于感染后1个月剖杀幼犬,收集成虫。(3)以18S rRNA(18S核糖体RNA)为内参基因,采用实时定量PCR检测猬迭宫绦虫成虫和裂头蚴不同部位及不同感染时期裂头蚴CP基因的表达情况。结果1.猬迭宫绦虫27kDa CP的编码cDNA去信号肽序列长954bp,编码一个含317个氨基酸的蛋白多肽,属于Peptidase_C39_like超家族。理论分子量35669.9Da,等电点5.92。2.SDS-PAGE电泳分析表明,该基因在原核表达系统中得到高效表达,产物分子量大小为35kDa,诱导产物主要以包涵体形式存在。3.小鼠经口感染裂头蚴30 min后腹腔内查见穿过胃肠壁的裂头蚴;感染后30min~6 h,裂头蚴主要见于胃肠腔、胃肠壁和腹腔内;感染24 h,有少量的裂头蚴移行至小鼠皮下肌肉组织;感染7 d后,多数裂头蚴移行至皮下肌肉组织寄生。4.实时荧光定量PCR检测猬迭宫绦虫27kDa CP基因在成虫及裂头蚴的不同部位均有表达,但成虫不同部位的表达量均低于幼虫时期。成虫不同部位的表达量依次为孕节>头节>成节,裂头蚴不同部位的表达量依次为体段>头段>尾段。在感染30min时,裂头蚴的27kDa CP基因表达量上调,其表达量是未感染时的2.1倍,随后表达量呈下调,至6h表达量最低,随后27kDa CP基因表达量呈上升趋势,至14d时达到峰值。结论1.猬裂头蚴27kDa CP属于Peptidase_C39_like超家族。2.成功构建了pET-28a(+)-SEP-CP原核表达体系。3.初步揭示了27kDa CP基因在猬迭宫绦虫成虫及裂头蚴的时空表达模式,提示27kDa CP基因可能参与了虫体的入侵、移行、营养吸收、生长发育及生殖等过程。