论文部分内容阅读
目的:优化重组p ET-28a(+)-MAF-1(Musca domestica antifungal peptide-1)原核表达体系。方法:1、比较E.coli BL21/(DE3)、E.coli Origami B/(DE3)两株宿主菌、不同的诱导温度、诱导时间和异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度对重组MAF-1原核表达结果的影响,融合蛋白用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行蛋白纯化,采用SDS-PAGE电泳和Quantity One凝胶电泳图像分析系统对表达结果检测分析,以确定最佳的表达条件。2、以白色念珠菌Candida albicans ATCC10231为指示菌,采用微量液体-菌落记数法检测重组MAF-1体外抗真菌活性,观察胰蛋白酶、热和冻融处理对表达产物抗真菌活性的影响;并检测重组MAF-1体外凝集活性、及溶血活性,以及重组MAF-1去除His后对抗真菌活性的影响。3、以家蝇重组MAF-1原核表达体系为基础,与课题组前期通过克隆获取的家蝇溶菌酶基因(lysozyme,LZM)构建成融合基因,采用同步酶切连接技术构建p ET-28a(+)-MAF-1-LZM/E.coli Origami B/(DE3)原核表达体系进行表达,并检测其活性。结果:1、p ET-28a(+)-MAF-1重组质粒选择E.coli Origami B/(DE3)作为宿主菌,在34℃、IPTG终浓度0.025mmol/L、诱导18小时的优化条件下获得重组MAF-1最大表达量,上清和纯化后的目的蛋白SDS-PAGE检测条带灰度值分别为:808±4、412±2,测得其蛋白浓度为0.706 mg/ml,而以E.coli BL21/(DE3)作为宿主菌,在37℃、IPTG终浓度1.0mmol/L、诱导6小时优化条件下可获得重组MAF-1的最大表达量,上清和纯化后的目的蛋白SDS-PAGE检测条带的灰度值分别为:258±5、173±7,测其蛋白浓度为0.401mg/ml,差别具有统计学意义(p<0.05);2、采用优化Origami B/(DE3)体系表达重组MAF-1对白色念珠菌显示出抑菌活性,其最低抑菌浓度70μg/ml,与E.coli BL21/(DE3)体系破包涵体复性后获取的重组MAF-1作用白色念珠菌的最低抑菌浓度100μg/ml比较,其抗真菌活性有所提高;重组MAF-1无凝集红细胞活性、无溶血活性,其在胰蛋白酶作用下丧失抗真菌活性,经95℃加热处理至120,及经-80℃度反复冻融处理,重组MAF-1抗真菌活性不被灭活,重组MAF-1 His标签是否去除对其抗菌活性无显著影响(p>0.05)。3、成功构建p ET-28a(+)-MAF-1-LZM原核表达质粒,并转化至E.coli Origami B/(DE3)中获得成功表达,其纯化后的重组MAF-1-LZM具有体外抗真菌活性,其最低抑菌浓度为100μg/ml。结论:1、筛选E.coli Origami B/(DE3)为p ET-28a(+)-MAF-1重组质粒的较适宜表达宿主菌,在34℃、IPTG终浓度0.025mmol/L、诱导18小时,可获得高效可溶性表达。2、Origami B/(DE3)表达体系重组MAF-1体外抗真菌活性较E.coli BL21/(DE3)体系有提高;无凝集活性,无溶血活性;其在胰蛋白酶作用丧失抗真菌活性;其具有耐热、耐冻融特性;His标签对其抗菌活性无显著影响。3、重组融合MAF-1-LZM在E.coli Origami B/(DE3)中成功表达,抗真菌实验显示其具有体外抗真菌活性,但MAF-1单体抗真菌活性并未增强。研究结果为进一步的分析MAF-1的功能提供了技术支撑。