研究背景肾素原受体((Pro)renin receptor,PRR)首次由Nguyen等发现,它与肾素结合而增强肾素活性,与肾素原结合而促进肾素原通过构象变化而非蛋白酶酶解活化。PRR作为一个组织特异性基因,不直接通过循环系统发挥作用,而是作为组织局部肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)的调节因子来发挥其功能。众多研究显示PRR在肾脏血管、近端小管、远端小管(Distal convoluted tubule,DCT)、连接小管和集合管等都有表达,存在3种不同的分子形式:全长的PRR(full-length PRR,f PRR)、可溶性的PRR(soluble PRR,s PRR)和M8.9(8.9k Da)。尽管目前有很多报道倾向于认为PRR调节液泡型H~+-ATP水解酶和Wnt/β-catenin信号通路,但是也有越来越多的证据说明肾脏和大脑组织等局部PRR的肾素调节功能。小鼠全身性PRR敲除是致死的,而对于PRR的抑制剂,目前有肾素原前段柄区肽(Handle Region Peptide,HRP,R10ILLKKMPSV19)和肾素原前段20个氨基酸多肽(the first 20 amino acid residues of the prorenin prosegment,PRO20,L1PTDTASFGRILLKKMPSVR20)两种,与HRP相比,PRO20是最新设计的,它能够有效地抑制局部RAS的活化以及Ang II和DOCA盐诱导的高血压的发生发展。钠(Sodium,Na~+)和钾(Potassium,K~+)是细胞内主要的阳离子,维持它们在体内平衡对生物体的生存至关重要。醛固酮被认为是调节体内电解质平衡的重要因子,过表达人PRR基因的大鼠分泌醛固酮增加,这提示PRR对肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin–angiotensin–aldosterone system,RAAS)具有调节作用。低盐或高盐处理都能促进肾脏PRR的表达,这与醛固酮分泌的变化相一致。研究还发现肾脏PRR可调节上皮钠通道(epithelial Na~+channel,ENa C)的表达及活性,这些结果进一步暗示了肾脏PRR在电解质代谢平衡中具有潜在的调节作用。研究目标基于以上背景,本研究,我们拟利用影响电解质平衡的高果糖模型和高钾模型,通过探讨高果糖/高钾对肾脏PRR表达及RAS的影响,以及观察肾脏PRR在肾内RAS活化和Na~+、K~+平衡调控中的作用,揭示肾脏PRR在肾脏RAS中的作用及其对电解质平衡调控的可能的分子机制。研究方法第一部分:肾素原受体对果糖诱导的盐敏感性高血压的调控作用及其机制(1)用20%果糖饮水处理SD大鼠,利用蛋白印迹(western blotting,WB)实验及逆转录-实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测肾脏PRR的表达,利用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血浆和尿液s PRR的水平。(2)用PRO20皮下注射干预20%果糖饮水处理的SD大鼠,利用ELISA方法检测血浆和尿液Ang II、醛固酮、肾素活性及肾素含量,利用WB和RT-q PCR方法检测肾脏强钠氢交换子3(sodium/hydrogen exchanger 3,NHE3)和钠钾氯共转运体(Na/K/2Cl cotransporter,NKCC2)的表达情况,利用呋塞米速尿实验检测NKCC2的体内活性,分析血浆及尿液的Na~+、K~+、Cl-及渗透压水平。(3)用PRO20皮下注射干预20%果糖饮水处理的SD大鼠,同时给予8%高盐进食并遥测法检测血压2周。(4)用别嘌呤醇干预20%果糖饮水处理的SD大鼠,利用ELISA方法检测血浆和尿液尿酸(uric acid,UA)、s PRR、Ang II、醛固酮、肾素活性及肾素含量,利用WB和RT-q PCR方法检测肾脏PRR、Renin、NHE3和NKCC2的表达情况,利用呋塞米速尿实验检测NKCC2的体内活性,分析血浆及尿液的Na~+、K~+、Cl-及渗透压水平。(5)用别嘌呤醇干预20%果糖饮水处理的SD大鼠,同时给予8%高盐进食并遥测法检测血压2周。(6)体外应用人肾近曲小管上皮细胞(Human renal proximal tubule epithelial cells,HK2),用高果糖处理,用别嘌呤醇干预,WB检测细胞PRR蛋白的表达,ELISA检测培养基中s PRR水平。第二部分:肾素原受体对钾平衡的调控作用及其机制(1)用5%K~+鼠粮(92 g正常鼠粮~+8 g KCl)处理正常SD大鼠,利用WB实验及RT-q PCR检测肾脏PRR的表达,ELISA检测血浆和尿液s PRR、醛固酮的水平。(2)用5%K~+鼠粮处理正常SD大鼠,同时皮下注射PRO20,利用ELISA方法检测血浆和尿液醛固酮、肾素活性及肾素含量,利用WB方法检测肾脏细胞色素P450家族11-B亚族-多肽2(Cytochrome P450,family 11,subfamily B,polypeptide 2,CYP11B2)、ENa C、钠氯共转运体(Na~+-Cl-cotransporter,NCC)、肾外髓钾通道(Renal outer medullary K~+channel,ROMK)、大电导、钙活化的钾通道(Large-conductance Calcium-activated K~+channel,BK)和α-钠-钾-ATP酶(Alpha Na~+-K~+-ATPase,α-NKA)的表达情况,免疫荧光方法检测NCC在DCT的表达情况,同时分析血浆及尿液的Na~+、K~+和Cl-水平。(3)为了进一步确定肾脏PRR对肾性醛固酮的合成及K~+平衡的调控作用,我们切除大鼠双侧肾上腺,用5%K~+鼠粮处理,并通过肾内灌注PRO20,同样分析肾脏PRR、CYP11B2、ENa C、NCC、ROMK、BK和α-NKA的表达,分析血浆和尿液的电解质、s PRR、醛固酮及肾素水平。(4)为了进一步确定肾性醛固酮的存在,我们利用双侧肾上腺切除大鼠,用5%K~+鼠粮处理,并通过口服螺内酯,分析血浆及尿液的电解质和醛固酮水平,分析肾脏PRR、CYP11B2、ENa C、NCC、ROMK、BK和α-NKA的表达水平。(5)肾脏集合管是肾脏调节K~+平衡的重要结构,因此,我们还利用原代培养的大鼠内髓集合管(inner medullary collecting duct,IMCD)细胞,用高钾处理,用PRO20或PRR si RNA干预,WB检测细胞PRR及CYP11B2蛋白的表达,ELISA检测培养基中s PRR、醛固酮及肾素水平。研究结果第一部分:肾素原受体对果糖诱导的盐敏感性高血压的调控作用及其机制(1)我们发现20%果糖饮水促进肾脏f PRR和s PRR蛋白及PRR m RNA的表达,增加尿s PRR的排泄以及血浆s PRR的浓度。(2)20%果糖饮水增加尿液Ang II和醛固酮的排泄,升高尿液肾素活性和肾素含量,升高肾脏NHE3和NKCC2蛋白及m RNA的表达水平,增强大鼠对呋塞米的速尿反应,以上这些变化均被PRO20皮下注射所逆转,但不影响血浆Ang II、醛固酮、肾素活性及肾素含量。(3)单独20%果糖饮水不会引起血压升高,在同时给予8%高盐进食时,血压高约升10 mm Hg,并且被PRO20完全阻断。(4)用别嘌呤醇抑制果糖代谢引起的肾脏内源性UA的升高,完全阻断了果糖对尿液Ang II和醛固酮排泄、尿液肾素活性和肾素含量、肾脏NHE3和NKCC2蛋白及m RNA的表达水平以及大鼠对呋塞米的速尿反应的刺激作用,但不影响血浆Ang II、醛固酮、肾素活性及肾素含量。(5)别嘌呤醇完全阻断了高果糖诱导的盐敏感性高血压。(6)体外HK2细胞实验,果糖促进细胞f PRR和s PRR蛋白的表达以及培养基s PRR的分泌,并且具有时间和剂量依赖性,并且完全被别嘌呤醇处理所抑制。第二部分:肾素原受体对钾平衡的调控作用及其机制(1)我们发现大鼠高钾进食显著升高肾脏f PRR的蛋白表达水平、24 h尿s PRR排泄,而降低血浆s PRR浓度,但对肾脏PRR m RNA的表达水平没有影响。(2)利用正常大鼠实验,皮下注射PRO20,显著抑制高钾诱导的尿液肾素活性及肾脏CYP11B2、ENa C、NCC、ROMK、BK和α-NKA的蛋白表达,进一步升高血钾浓度,降低尿钠、钾和醛固酮的排泄。(3)利用双侧肾上腺切除大鼠实验,肾内灌注PRO20,同样可以观察到显著抑制高钾引起的尿液肾素活性及醛固酮的升高,降低肾脏CYP11B2、ENa C、NCC、ROMK、BK和α-NKA的蛋白表达,而对f PRR的蛋白表达及尿s PRR没有影响,也发现进一步升高血钾浓度,抑制尿钠、钾的排泄。(4)利用双侧肾上腺切除大鼠实验,同时口服螺内酯,螺内酯进一步增加高钾进食引起的血钾浓度的升高和尿钠排泄,而减低尿钾排泄和血钠浓度,而不影响尿醛固酮的排泄,同时也降低高钾引起的肾脏ENa C、ROMK、BK和α-NKA的蛋白表达。(5)体外原代培养的IMC D细胞,K~+而非Cl-处理促进细胞f PRR和CYP11B2蛋白的表达及醛固酮的合成与分泌。PRO20或PRR si RNA处理,显著抑制CYP11B2蛋白的表达及培养基醛固酮含量和肾素活性。s PRR和肾素原可直接刺激IMCD细胞表达CYP11B2和分泌醛固酮,敲除PRR后显著抑制肾素原的作用。研究结论通过本研究,我们得出以下结论:(1)高果糖通过代谢产生UA刺激肾脏PRR的表达,激活肾内RAS,从而调节肾脏NHE3和NKCC2的表达与活性,调节肾脏对Na~+的重吸收,调节果糖诱导的盐敏感性高血压的发生发展;(2)高钾促进肾脏PRR的表达,活化肾内RAAS,促进肾脏CYP11B2的表达,从而促进肾脏合成和分泌醛固酮,进而调节肾脏ENa C、NCC、ROMK、BK和α-NKA的表达,调节K~+分泌与排泄。这一研究进一步揭示了肾脏局部RAS的功能和调节机制,以及肾脏PRR在电解质平衡过程中的调控作用和机制,并为此提供了新的视角。