论文部分内容阅读
目的：建立心肌细胞的高糖损伤模型；观察高糖环境下胰岛素对心肌细胞凋亡的影响及内质网应激相关分子标志物的表达；观察PI3K/AKT信号通路在高糖引起心肌细胞损伤中的作用。方法：1.心肌细胞培养和高糖损伤模型大鼠心肌来源的H9c2细胞的常规培养使用5.5 mmol/L低糖DMEM,加入10%FBS。用35mmol/L高糖(HG, High Glucose) DMEM培养基孵育细胞不同时间(6h,12h,24h,48h,72h),建立心肌细胞高糖损伤模型。2.细胞活力和凋亡检测将细胞分为对照组(低糖5.5 mmol/L)、高糖组(35 mmol/L)、胰岛素组(INS,100nmol/L)、胰岛素+高糖组。用MTT法检测细胞活力,分别观察0,24h,48h,72h和96h并记录数据。根据细胞活力的数据分析选择48h时间点做凋亡检测,实验分组同上,Hoechst染色检测细胞凋亡。3. RT-PCR检测内质网应激相关分子标记物的表达高糖处理H9c2细胞不同时间后,提取细胞总mRNA,检测高糖对GRP78mRNA表达的时间效应。根据时间效应的结果,以48h为时间点,细胞分为4组：对照组(control),高糖组(HG),胰岛素+高糖组,LY294002+胰岛素+高糖组(LY294002预处理30min后,加入高糖和胰岛素处理),检测各组GRP78mRNA的表达。LY294002是PI3K/AKT信号通路特异性的抑制剂。4. Westen-blot检测蛋白表达实验分组：对照组(control),高糖组(HG),胰岛素组,LY294002组,胰岛素+高糖组,LY294002+胰岛素+高糖组,48h后Western blot检测各组细胞中t-Akt和p-Akt的蛋白表达水平。LY294002是PI3K/AKT信号通路特异性的抑制剂。结果：与对照组相比,高糖处理48h后,细胞活力下降(P<0.5)；与高糖组比较,胰岛素处理可以显著提高细胞活力,细胞凋亡数也显著减少；且48h时Hochest染色显示,高糖组细胞核固缩,染色质向外周聚集,或者细胞核碎裂成凋亡小体；RT-PCR结果提示高糖处理24h时,GRP78 mRNA水平表达被上调(P<0.01 vs. control);与高糖组相比,胰岛素+高糖组p-Akt蛋白的表达显著增加(P<0.01),且LY294002能明显抑制胰岛素引起的p-Akt的表达上调(P<0.01)。结论高糖可通过内质网应激引起心肌细胞凋亡,胰岛素通过PI3K/AKT信号通路的活化,保护心肌细胞因高糖刺激引起的内质网应激损伤。