论文部分内容阅读
前言 目前，乳腺癌是我国女性中的主要恶性肿瘤之一，它不仅是局限性疾病，更是全身性疾病。对其治疗也由局部治疗转变为以局部和系统性的综合治疗为主。术前化疗亦称之为新辅助化疗，目前已应用于在乳腺癌的治疗中，而且在局部进展期乳腺癌的应用中已取得良好的效果。 细胞凋亡调控异常与肿瘤发生、进展有关；化疗、放疗、内分泌治疗均可导致肿瘤细胞的凋亡。bcl-2能阻止各种刺激引起的凋亡的发生，促进细胞存活。Ki67是一种与细胞密切相关的核抗原，存在于细胞周期的G1后期、S、G2、M期，而不存在于静止的G0箱期细胞，是应用广泛的增殖细胞标记之一，被用以估计肿瘤细胞的增殖能力。本实验观察乳腺癌用CEF方案新辅助化疗肿瘤组织标本中Ki-67、bcl-2和细胞凋亡指数，对比观察化疗前后的表达率与临床疗效间的关系，探讨这些指标对预测化疗敏感性的价值。 实验材料和方法 收集2002年1月～2003年6月，乳腺癌（T＞3cm）患者66例，化疗前用Core法取得肿瘤组织（2～4块），制成石蜡包埋块，切成4μm备用。确诊58例，均为女性，年龄29-67岁，平均年龄49.8岁。给予三个周期CEF方案新辅助化疗，检测Ki-67、bcl-2及AI三项指标在化疗前后均存在，并可配对计算的共42例。 凋亡指数的测定采用原位细胞末端转移标记法（TUNEL法）。原位细胞凋亡试剂盒购自华美生物工程有限公司。常规脱蜡入水，切片用新鲜配制的3％H2O2水溶液灭活内源性酶，PBS水洗5分钟3次；30μg/ml蛋白酶K37℃消化45分钟，用双蒸水洗5分钟3次；加标记缓冲液室温20分钟，甩干后将TdT、Biotin-11-dUTP和标记缓冲液的混合液加于切片上，37℃ 60分钟后甩2×SSC浸泡，PBS水洗3分钟3次；DAB显色，苏木素复染，封片镜检。TdT去除液用于阴性对照，用断奶4天后的母鼠乳腺作为阳性对照。 bcl-2与Ki67表达检测采用ABC法，bcl-2即用型SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。常规脱蜡入水，切片用新鲜配制的3％H2O2水溶液灭活内源性酶，双蒸水洗3次;滴加复合消化液10分钟，双蒸水洗3次;用正常山羊血清封闭液室温20分钟后，甩去多余的液体不洗，滴加小鼠抗人bcl一或Ki67单克隆抗体，4℃过夜，PBS水洗2分钟3次;滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室温20分钟PBS水洗5分钟4次;DAB显色，苏木素复染，常规封片镜检。以PBS代替一抗做阴性对照，试剂盒中阳性对照片用于阳性对照。 凋亡指数的测定中，细胞核有棕黄色颗粒者为阳性细胞。凋亡细胞计数用凋亡指数（AI）表示，在400倍镜下随机选择10个视野，计算出每100个肿瘤细胞中阳性细胞数，用于统计分析。 在bcl一检测中，细胞浆中有棕黄色颗粒者为阳性细胞;儿67检测中，细胞核有棕黄色颗粒者为阳性细胞。随机选择10个400倍镜下视野，以阳性细胞占总数的百分率进行计算。 用SPSS 10 .0统计软件进行统计学分析，组间比较采用x，检验。实验结果 1.化疗疗效及临床特征:CEF方案化疗有效率为62 .1%。统计学分析显示，化疗疗效好坏与绝经状态、肿瘤大小、淋巴结情况、组织学类型、雌激素受体状态无关（P>0.05）。 2.CEF新辅助化疗前儿石7、bcl讹及Al表达情况与化疗效果关系:统计学分析显示，术前CEF方案化疗对于凡石7高表达的患者更有效（P<0.05）。化疗前检测到的bcl一表达高低与临床疗效无关（P>0.05）。AI‘值的高低与化疗疗效间没有显著的统计学差异（P>0 .05）。 3.CEF新辅助化疗前后儿价、bcl一及AI表达率的比较:统计学分析显示，化疗后Ki石7阳性表达率和AI值显著降低，而bcl一的阳性表达率显著升高，三者均有显著性意义（P<0.05）。 4.CEF化疗前、后苟石7、bcl一及从表达变化情况与疗效关系:统计学分析显示在PR患者中，三个指标的变化均有显著性差异（P<0.01）。讨论肿瘤细胞的发生发展及退化与细胞凋亡和增殖之间的平衡有密切关 系，两者共同参与维持组织细胞的稳定性，这种平衡关系在化疗后仍持续存 在。在化疗前由于bcl一低表达，肿瘤细胞的增殖速度也相应的增高。bcl- 2是重要的抑制凋亡的基因，其表达延长肿瘤细胞的寿命，使肿瘤以较慢的 速度生长。而化疗后bd一表达增加，肿瘤细胞增殖速度的降低，AI值也有 着相应的减少，AI值的降低也从另一个侧面反映了肿瘤细胞增殖速度的降 低，同样表明这种平衡关系的存在。 本研究结果，治疗前几价有高表达的肿瘤对化疗反应好。在化疗后 肿瘤组织中儿价、Al表达明显降低，而bcl一表达增加，这与以前的报道结 果一致。细胞毒性药物对增殖活跃的细胞更有效，而增殖缓慢的细胞在三 个周期化疗过程中有选择性的存活下来。AI降低与bcl-2增高反映出这类 细胞可能分化较好或处于休眠期;bcl一表达增高现象的另一种解释是因 为瘤体的血管更少，残留组织周围处于乏氧状态，bcl-2表达的细胞在相对 缺氧区有生存空间，来保护肿瘤细胞免于凋亡。因此检测新辅助化疗前儿- 67表达情况，以及化疗前后检测肿瘤组织中凋亡指数以及儿67和bcl佗等 生物学指标变化将有助于观察疗效及估计