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目的:microRNA(miRNA)是一类长度为20~23nt的在多种真核生物中可以调控基因表达的高度保守非编码小RNA[1,2]。miRNA可以通过与一个或多个mRNA的部分序列互补而调控基因表达进而影响生命活动,它的功能失调常常会引起重要过程出现紊乱,包括器官变化、细胞分化、细胞增殖、细胞存活等[3,4]。而在肿瘤的发生过程中,不同的miRNA可能起着癌基因或者抑癌基因的作用。目前,肺癌是发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一,其病理类型主要为两种,一是进展性较快的小细胞癌,占总体比例的13~15%左右,二是非小细胞癌,包括腺癌,鳞状细胞癌,大细胞癌,大细胞神经内分泌癌等,占总体比例的85%左右[5,6]。肺癌预后较差的原因有多方面,转移是影响肺癌患者疗效和生存时间的关键问题之一,明确的转移机制目前仍然不清楚,因此缺乏有效的治疗手段。目前研究发现,miRNA-449a在胃癌、膀胱癌、前列腺癌等癌症中均有抑癌作用,而miRNA-449a对于肺癌的生物学功能影响尚不清楚,在本研究中我们试图通过对miRNA-449a在肺癌中的生物学作用进行研究,探讨肺癌发生发展过程中的内在机制,为提高肺癌的早期诊断、特异性治疗及预后判断水平提供新的思路,同时探索肺癌的特异性新靶标。方法:(1)基因芯片分析:分别提取高、低不同转移潜能人肺巨细胞癌细胞株95D/95C的总RNA,应用MicroRNA芯片技术检测95C/95D中miRNA-449a的差异性表达水平;(2)使用real-time PCR技术对差异表达的miRNA-449a进行验证:首先提取人肺巨细胞癌细胞株95C/95D的总RNA,然后设计miRNA-449a的反转录引物及上游引物和下游引物,设置内参U6为对照,反转录RNA检测miRNA-449a在95C/95D细胞株中的表达水平,同时使用琼脂糖凝胶电泳对real-time PCR产物进行鉴定。(3)构建过表达miRNA-449a的真核表达载体pCDNA3.1-miR-449a:首先根据miRBase数据库确定miRNA-449a的序列,设计miRNA-449a的扩增引物进行扩增,扩增目的基因并进行鉴定后构建真核表达载体pCDNA3.1-miR-449a,通过酶切及基因测序再次鉴定。(4)建立过表达miRNA-449a的稳定细胞株95D-pCDNA3.1-miR-449a:使用真核表达载体pCDNA3.1-miR-449a转染细胞株95D后应用潮霉素进行筛选,筛选出可稳定过表达miR-449a的细胞株95D-pCDNA3.1-miR-449a并通过real-timePCR技术进行验证。(5)95D-pCDNA3.1-miR-449a细胞株增殖能力检测:设置空白对照组及阴性对照组后,使用MTT法检测稳定过表达miR-449a后95D细胞株增殖能力的变化。(6)95D-pCDNA3.1-miR-449a细胞株迁移能力检测:设置空白对照组及阴性对照组后,使用划痕试验检测稳定过表达miR-449a后95D细胞株迁移能力的变化。(7)95D-pCDNA3.1-miR-449a细胞株侵袭能力检测:设置空白对照组及阴性对照组后,使用Boyden小室实验检测稳定过表达miR-449a后95D细胞株侵袭能力的变化。结果:(1)MicroRNA芯片显示在低转移潜能人肺巨细胞癌细胞株95C中的miRNA-449a水平明显高于高转移潜能人肺巨细胞癌细胞株95D,real-time PCR再次证实了miRNA-449a在人肺巨细胞癌细胞株95C中的水平高于人肺巨细胞癌细胞株95D(;2)成功构建能够过表达miRNA-449a的真核表达载体pCDNA3.1-miR-449a,得到酶切和基因测序的证实后,进一步建立了可过表达miRNA-449a的稳定细胞株95D-pCDNA3.1-miR-449a,并通过了real-time PCR验证;(3)MTT实验证明过表达miRNA-449a后对95D细胞株的增殖无影响(P﹥0.05);划痕试验表明经过48h培养后,95D-pCDNA3.1-miR-449a细胞株的划痕宽度(298.3±4.382μm)明显大于空白对照组(106.7±3.753μm)和转染空载体组(89.1±4.017μm)(P<0.01),证明过表达miR-449a可以使95D细胞株迁移能力降低; Boyden小室实验表明,95D-pCDNA3.1-miR-449a的细胞透膜数(53.79±3.972)明显小于空白对照组(162.28±3.819)和转染空载体组(150.63±4.625)(P <0.01),证明过表达miR-449a可以使95D细胞株侵袭能力降低。结论:(1)miR-449a在低转移性人肺巨细胞癌细胞株95C中的表达水平明显高于在高转移性人肺巨细胞癌细胞株95D中的水平,提示其可能与肺癌转移相关,有可能成为肺癌治疗的目的基因。(2)成功构建了真核表达载体pCDNA3.1-miR-449a,并建立了稳定过表达miR-449a的95D-pCDNA3.1-miR-449a细胞株,为研究miR-449a对肺癌细胞的生物学功能的影响奠定了基础。(3)过表达miR-449a可以使肺癌细胞株95D的迁移及侵袭能力降低,而增殖能力无变化,显示miR-449a可以抑制肺癌细胞的迁移及侵袭能力,提示miR-449可能与肺癌的转移相关,为肺癌的早期诊断及基因靶向治疗和预后判断提供了新的理论基础。