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第一部分：淋巴毒素信号通路在淋巴管畸形中的表达及分布
目的：淋巴毒素信号通路在自身免疫疾病、炎症反应及肿瘤的发生及发展等病理过程中发挥着重要的的作用。本部分的研究中旨在探索淋巴毒素、淋巴毒素受体及下游信号通路分子在淋巴管畸形中的表达与分布，并进一步分析细胞增殖水平与NF-κB信号通路活化程度之间的关系，评价淋巴毒素信号通路在淋巴管畸形发生及发展中的作用。
方法：利用酶联免疫吸附实验、免疫组织化学及实时定量PCR检测淋巴毒素LT-α、LT-β、LIGHT和淋巴毒素受体TNFR1、TNFR2、LTβR在淋巴管畸形中的分布及表达；同时检测NF-κB经典及非典型信号通路转录因子在淋巴内皮细胞核转移情况，以及淋巴内皮细胞增殖指标Ki67的表达；对被检测的26例临床组织标本中淋巴内皮细胞的增殖水平及淋巴毒素信号通路指标之间的相关性进行聚类分析。
结果：淋巴毒素主要表达在淋巴管畸形内的三级淋巴结构内。在淋巴管畸形组织内淋巴内皮细胞的TNFR1、TNFR2及LTβR的表达水平明显高于正常皮肤组织，并在伴发感染的淋巴管畸形内进一步升高。在淋巴管畸形中，特别是伴发感染的淋巴管畸形标本内淋巴内皮细胞NF-κB信号通路的的活化程度明显高于正常皮肤组织。聚类分析提示淋巴毒素、NF-κB转录因子和Ki67的表达呈正相关趋势，相较于其他淋巴毒素，LT-α和Ki67的表达表现出更高的相关性。
结论：淋巴毒素LT-α、LT-β、LIGHT以及淋巴毒素受体在淋巴管畸形中高表达。淋巴毒素下游信号通路，包括经典及非典型信号通路，以及增殖指标Ki67在淋巴管畸形的淋巴内皮细胞中活化程度明显，上述指标间高度的相关性，提示淋巴毒素可能通过NF-κB信号通路促进淋巴内皮细胞增殖，从而参与淋巴管畸形发生及发展。
第二部分：大鼠淋巴管畸形模型的建立及淋巴毒素信号通路促进淋巴管畸形发生发展的机制研究
目的：本部分的研究使用淋巴毒素体外刺激人原代皮肤淋巴内皮细胞，旨在获得淋巴毒素信号通路促进淋巴内皮细胞增殖的直接证据。同时，向大鼠颈部皮下注射弗式不完全佐剂诱导出具有良好重复性的淋巴管畸形动物模型。在脂多糖的刺激下，利用此模型模拟人淋巴管畸形炎症状态，进一步分析淋巴毒素信号通路促进淋巴管畸形发生发展的潜在机制。
方法：利用细胞免疫荧光、蛋白免疫印迹等方法检测淋巴毒素对人原代皮肤淋巴内皮细胞中NF-κB信号通路的活化和增殖水平的上调。小干扰RNA抑制淋巴毒素受体的表达，以此具体分析信号通路的走向。在大鼠颈部皮下注射弗式不完全佐剂，建立大鼠淋巴管畸形模型。采用免疫组织化学的手段检测模型组织内淋巴毒素信号通路和内皮细胞增殖水平的关系。
结果：体外实验结果显示，淋巴毒素可以激活人皮肤淋巴内皮细胞中NF-κB信号通路。脂多糖能上调人皮肤淋巴内皮细胞中淋巴毒素受体的表达，并增强淋巴内皮细胞对淋巴毒素的反应性，增殖水平进一步升高。在大鼠淋巴管畸形模型中，LPS能增加病损的体积。对分离出的肿物进行免疫组织化学染色显示，LPS能显著升高组织内淋巴毒素的表达水平，并促进内皮细胞NF-κB信号通路的活化和增殖指标Ki67的表达。LT-α亦能通过NF-κB经典信号通路促进淋巴内皮细胞Ki67的表达。使用中和抗体抑制淋巴毒素信号通路会抑制LPS对淋巴管畸形发展的促进作用。
结论：淋巴毒素和LPS能明显促进淋巴内皮细胞增殖水平，其功能的发挥更多依赖于淋巴毒素受体TNFR1和LTβR。淋巴管畸形模型中，炎症相关的淋巴毒素通过NF-κB信号通路增强淋巴内皮细胞的增殖水平，从而促进淋巴管畸形的发生及发展。
第三部分：淋巴毒素在头颈鳞癌中的主要来源及其对肿瘤血管生成的影响和机制研究
目的：本部分的研究通过临床组织芯片结果和体外头颈鳞癌细胞与淋巴细胞共培养体系，试图寻找头颈鳞癌中淋巴毒素-α(LT-α)的分泌来源。进一步探究LT-α对内皮细胞糖酵解代谢、增殖、迁移和成管过程的调控作用及机制。
方法：利用网络数据库肿瘤免疫评估系统(TIMER)和头颈鳞癌标本组织芯片染色分析LT-α表达水平和淋巴细胞浸润的相关性。建立头颈鳞癌细胞Cal27和人原代淋巴细胞共培养体系，通过流式细胞术、实时定量PCR和ELISA检测肿瘤细胞对浸润淋巴细胞的影响。通过细胞代谢实验、EdU渗入实验、Transwell迁移实验、细胞周期实验、基质胶成管实验，检测LT-α对内皮细胞血管生成的调控作用。利用蛋白免疫印迹实验寻找LT-α活化内皮细胞背后的信号通路。
结果：肿瘤免疫评估系统(TIMER)提取的数据和组织芯片分析的结果提示头颈鳞癌内LT-α的表达水平和淋巴细胞的浸润程度呈正相关。共培养体系中，头颈鳞癌细胞Cal27上调B、T淋巴细胞LT-α分泌能力，B淋巴细胞尤为明显。LT-α能激活人脐静脉内皮细胞(HUVECs)糖酵解代谢，促进HUVECs葡萄糖摄取、乳酸生成和ATP产生。蛋白免疫印迹结果发现增强的糖酵解依赖糖酵解关键酶PFKFB3的表达。而且LT-α对HUVECs增殖、迁移、成管、细胞周期和伪足形成的促进作用，亦表现PFKFB3依赖性。利用信号通路抑制剂和小干扰RNA发现NF-κB信号通路参与LT-α对PFKFB3的表达的调控。
结论：头颈鳞癌中浸润的淋巴细胞能够分泌淋巴毒素LT-α，通过上调PFKFB3依赖的糖酵解水平激活内皮细胞，促进肿瘤血管生成。依赖PFKFB3的糖酵解调控功能，LT-α能够驱动血管内皮细胞周期促进细胞增殖，并且也能促进细胞伪足形成，增强细胞迁移能力。
第四部分抑制内皮细胞PFKFB3降低肿瘤血管生成
目的：本部分的研究通过使用PFKFB3的竞争性抑制剂，探究抑制PFKFB3的表达对血管内皮细胞血管生成相关行为的影响，旨在探讨PFKFB3是否能够作为治疗靶点，抑制内皮细胞糖酵解代谢水平，从而达到抑制肿瘤血管生成的目的。
方法：使用竞争性抑制剂PFK15抑制PFKFB3的功能。在此基础上通过细胞代谢实验、EdU渗入实验、Transwell迁移实验、细胞周期实验、基质胶成管实验检测PFKFB3对内皮细胞血管生成相关行为的影响。建立裸鼠移植瘤模型，检测PFK15对头颈鳞癌Cal27移植瘤生长的作用.借助免疫组织化学对裸鼠移植瘤连续切片染色，进一步检测肿瘤组织标本内CD31阳性的新生血管的形成状况。
结果：PFK15在内皮细胞中抑制LT-α对葡萄糖摄取、乳酸生成和ATP产生的促进作用。同时内皮细胞的增殖、迁移和成管能力，亦随着PFKFB3功能的抑制而降低。进一步，PFK15的应用使得Cal27移植瘤的体积和和重量明显减少，免疫组织化学检测发现PFK15能显著降低肿瘤组织标本内CD31阳性的新生血管管腔的形成。
结论：抑制PFKFB3在体内和体外均能有效降低血管生成。使用小分子类抑制剂，以PFKFB3为靶点的血管生成抑制疗法，具有良好的肿瘤治疗前景。
目的：淋巴毒素信号通路在自身免疫疾病、炎症反应及肿瘤的发生及发展等病理过程中发挥着重要的的作用。本部分的研究中旨在探索淋巴毒素、淋巴毒素受体及下游信号通路分子在淋巴管畸形中的表达与分布，并进一步分析细胞增殖水平与NF-κB信号通路活化程度之间的关系，评价淋巴毒素信号通路在淋巴管畸形发生及发展中的作用。
方法：利用酶联免疫吸附实验、免疫组织化学及实时定量PCR检测淋巴毒素LT-α、LT-β、LIGHT和淋巴毒素受体TNFR1、TNFR2、LTβR在淋巴管畸形中的分布及表达；同时检测NF-κB经典及非典型信号通路转录因子在淋巴内皮细胞核转移情况，以及淋巴内皮细胞增殖指标Ki67的表达；对被检测的26例临床组织标本中淋巴内皮细胞的增殖水平及淋巴毒素信号通路指标之间的相关性进行聚类分析。
结果：淋巴毒素主要表达在淋巴管畸形内的三级淋巴结构内。在淋巴管畸形组织内淋巴内皮细胞的TNFR1、TNFR2及LTβR的表达水平明显高于正常皮肤组织，并在伴发感染的淋巴管畸形内进一步升高。在淋巴管畸形中，特别是伴发感染的淋巴管畸形标本内淋巴内皮细胞NF-κB信号通路的的活化程度明显高于正常皮肤组织。聚类分析提示淋巴毒素、NF-κB转录因子和Ki67的表达呈正相关趋势，相较于其他淋巴毒素，LT-α和Ki67的表达表现出更高的相关性。
结论：淋巴毒素LT-α、LT-β、LIGHT以及淋巴毒素受体在淋巴管畸形中高表达。淋巴毒素下游信号通路，包括经典及非典型信号通路，以及增殖指标Ki67在淋巴管畸形的淋巴内皮细胞中活化程度明显，上述指标间高度的相关性，提示淋巴毒素可能通过NF-κB信号通路促进淋巴内皮细胞增殖，从而参与淋巴管畸形发生及发展。
第二部分：大鼠淋巴管畸形模型的建立及淋巴毒素信号通路促进淋巴管畸形发生发展的机制研究
目的：本部分的研究使用淋巴毒素体外刺激人原代皮肤淋巴内皮细胞，旨在获得淋巴毒素信号通路促进淋巴内皮细胞增殖的直接证据。同时，向大鼠颈部皮下注射弗式不完全佐剂诱导出具有良好重复性的淋巴管畸形动物模型。在脂多糖的刺激下，利用此模型模拟人淋巴管畸形炎症状态，进一步分析淋巴毒素信号通路促进淋巴管畸形发生发展的潜在机制。
方法：利用细胞免疫荧光、蛋白免疫印迹等方法检测淋巴毒素对人原代皮肤淋巴内皮细胞中NF-κB信号通路的活化和增殖水平的上调。小干扰RNA抑制淋巴毒素受体的表达，以此具体分析信号通路的走向。在大鼠颈部皮下注射弗式不完全佐剂，建立大鼠淋巴管畸形模型。采用免疫组织化学的手段检测模型组织内淋巴毒素信号通路和内皮细胞增殖水平的关系。
结果：体外实验结果显示，淋巴毒素可以激活人皮肤淋巴内皮细胞中NF-κB信号通路。脂多糖能上调人皮肤淋巴内皮细胞中淋巴毒素受体的表达，并增强淋巴内皮细胞对淋巴毒素的反应性，增殖水平进一步升高。在大鼠淋巴管畸形模型中，LPS能增加病损的体积。对分离出的肿物进行免疫组织化学染色显示，LPS能显著升高组织内淋巴毒素的表达水平，并促进内皮细胞NF-κB信号通路的活化和增殖指标Ki67的表达。LT-α亦能通过NF-κB经典信号通路促进淋巴内皮细胞Ki67的表达。使用中和抗体抑制淋巴毒素信号通路会抑制LPS对淋巴管畸形发展的促进作用。
结论：淋巴毒素和LPS能明显促进淋巴内皮细胞增殖水平，其功能的发挥更多依赖于淋巴毒素受体TNFR1和LTβR。淋巴管畸形模型中，炎症相关的淋巴毒素通过NF-κB信号通路增强淋巴内皮细胞的增殖水平，从而促进淋巴管畸形的发生及发展。
第三部分：淋巴毒素在头颈鳞癌中的主要来源及其对肿瘤血管生成的影响和机制研究
目的：本部分的研究通过临床组织芯片结果和体外头颈鳞癌细胞与淋巴细胞共培养体系，试图寻找头颈鳞癌中淋巴毒素-α(LT-α)的分泌来源。进一步探究LT-α对内皮细胞糖酵解代谢、增殖、迁移和成管过程的调控作用及机制。
方法：利用网络数据库肿瘤免疫评估系统(TIMER)和头颈鳞癌标本组织芯片染色分析LT-α表达水平和淋巴细胞浸润的相关性。建立头颈鳞癌细胞Cal27和人原代淋巴细胞共培养体系，通过流式细胞术、实时定量PCR和ELISA检测肿瘤细胞对浸润淋巴细胞的影响。通过细胞代谢实验、EdU渗入实验、Transwell迁移实验、细胞周期实验、基质胶成管实验，检测LT-α对内皮细胞血管生成的调控作用。利用蛋白免疫印迹实验寻找LT-α活化内皮细胞背后的信号通路。
结果：肿瘤免疫评估系统(TIMER)提取的数据和组织芯片分析的结果提示头颈鳞癌内LT-α的表达水平和淋巴细胞的浸润程度呈正相关。共培养体系中，头颈鳞癌细胞Cal27上调B、T淋巴细胞LT-α分泌能力，B淋巴细胞尤为明显。LT-α能激活人脐静脉内皮细胞(HUVECs)糖酵解代谢，促进HUVECs葡萄糖摄取、乳酸生成和ATP产生。蛋白免疫印迹结果发现增强的糖酵解依赖糖酵解关键酶PFKFB3的表达。而且LT-α对HUVECs增殖、迁移、成管、细胞周期和伪足形成的促进作用，亦表现PFKFB3依赖性。利用信号通路抑制剂和小干扰RNA发现NF-κB信号通路参与LT-α对PFKFB3的表达的调控。
结论：头颈鳞癌中浸润的淋巴细胞能够分泌淋巴毒素LT-α，通过上调PFKFB3依赖的糖酵解水平激活内皮细胞，促进肿瘤血管生成。依赖PFKFB3的糖酵解调控功能，LT-α能够驱动血管内皮细胞周期促进细胞增殖，并且也能促进细胞伪足形成，增强细胞迁移能力。
第四部分抑制内皮细胞PFKFB3降低肿瘤血管生成
目的：本部分的研究通过使用PFKFB3的竞争性抑制剂，探究抑制PFKFB3的表达对血管内皮细胞血管生成相关行为的影响，旨在探讨PFKFB3是否能够作为治疗靶点，抑制内皮细胞糖酵解代谢水平，从而达到抑制肿瘤血管生成的目的。
方法：使用竞争性抑制剂PFK15抑制PFKFB3的功能。在此基础上通过细胞代谢实验、EdU渗入实验、Transwell迁移实验、细胞周期实验、基质胶成管实验检测PFKFB3对内皮细胞血管生成相关行为的影响。建立裸鼠移植瘤模型，检测PFK15对头颈鳞癌Cal27移植瘤生长的作用.借助免疫组织化学对裸鼠移植瘤连续切片染色，进一步检测肿瘤组织标本内CD31阳性的新生血管的形成状况。
结果：PFK15在内皮细胞中抑制LT-α对葡萄糖摄取、乳酸生成和ATP产生的促进作用。同时内皮细胞的增殖、迁移和成管能力，亦随着PFKFB3功能的抑制而降低。进一步，PFK15的应用使得Cal27移植瘤的体积和和重量明显减少，免疫组织化学检测发现PFK15能显著降低肿瘤组织标本内CD31阳性的新生血管管腔的形成。
结论：抑制PFKFB3在体内和体外均能有效降低血管生成。使用小分子类抑制剂，以PFKFB3为靶点的血管生成抑制疗法，具有良好的肿瘤治疗前景。