发酵鱼制品作为许多国家饮食文化的重要组成部分,深受国内外消费者的喜爱。近几年,随着消费者健康饮食理念的不断升级,能够常温保藏、带骨即食的发酵酸鱼制品的市场价值显著增加,其工业化生产是淡水鱼加工的一个重要发展方向。本实验室前期已经从传统酸鱼中分离纯化出多种优势菌株,并建立了以植物乳杆菌、木糖葡萄球菌和酿酒酵母混合接种的发酵工艺,解决了传统酸鱼发酵时间长、风味品质不稳定和安全性难以保障的技术难题,为酸鱼的工业化生产奠定了基础。但是由于发酵过程中酸鱼风味的形成机制还不明确,在工业化生产中对酸鱼的风味进行提升和靶向调控仍存在困难。因此,本论文主要对酸鱼发酵过程中的典型风味特征进行研究;通过分析与特征风味相关的前体物质和关键酶活变化,探明酸鱼特征风味物质的代谢规律;并基于风味代谢规律对特征风味物质形成途径中的酶编码基因进行物种注释,预测在发酵过程中能够产生特征风味物质的关键微生物;进一步揭示这些关键微生物在发酵过程中的演替规律,探明其与特征风味物质形成之间的关系。本课题对揭示发酵风味形成机制具有重要的学术价值,同时也能够为酸鱼特征风味的定向调控提供理论依据。(1)为了明确酸鱼发酵过程中的特征风味,对酸鱼进行接种发酵,采用HS-SPMEGC/MS结合GC-MS-O和电子鼻等多种技术对酸鱼不同发酵周期的挥发性化合物进行鉴定。结果表明,发酵第一周是挥发性物质种类增加最为明显的阶段,由37种增加到58种化合物,奠定了发酵酸鱼风味形成的基础。将气味活性值与GC-MS-O风味强度结果相结合,共筛选出21种关键挥发性风味。利用OPLS-DA模型结合聚类分析进一步将酸鱼整个发酵过程分为原料鱼、发酵前期(0-2周)和发酵后期(2-4周)3个阶段,为酸鱼整个发酵过程提供了关键监测点。根据OPLS-VIP值筛选出了9种能够区别不同发酵阶段的差异风味物质,包括乳酸乙酯、十六酸乙酯、4-乙烯基愈创木酚、2-辛烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2-乙酰基呋喃、辛酸乙酯、苯甲醛和异戊酸,这些风味物质可作为酸鱼发酵过程中风味品质监测的关键指标。(2)为了明确酸鱼特征风味物质在发酵过程中的代谢规律,进一步对可能形成酸鱼特征风味的前体物质及关键酶进行分析,并明确二者与特征风味之间的关系。根据O2PLS模型中的变量重要性指标发现,对酸鱼特征风味影响较大的氨基酸主要有天冬氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和半胱氨酸;对酸鱼特征风味影响较大的脂肪酸主要有C16:0、C20:5、C20:4、C18:1、C22:6、C18:0和C16:1。对风味物质与风味前体之间的关系进行分析发现,乳酸乙酯、乙醛、苯甲醛、苯乙醇和4-甲基愈创木酚等特征风味主要与氨基酸有较强的相关性;己醛、辛醛、壬醛、(E,E)-2,6-壬二烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛主要与脂肪酸有较强的相关性;其他特征风味物质的动态变化与氨基酸和脂肪酸均有较强的相关性。对风味不同代谢过程中关键酶活的变化规律进行了分析,发现磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、脂氧合酶、氢过氧化物裂解酶和醇酰基转移酶的活性均在发酵第一周达到最大值,分别为544 U/g、66 U/g、21.9 U/g、37.8 U/g和26.4 U/g。而己糖激酶、支链氨基酸转移酶、芳香族氨基酸转移酶和酯酶随着发酵进行,酶活性均不断下降。源于糖酵解代谢的风味物质主要在发酵第一周产生,源于脂氧合酶途径的风味物质主要在发酵前两周生成,氨基酸的转氨反应也主要发生在发酵前两周。根据O2PLS模型中的变量重要性指标发现,影响发酵前期风味的关键酶主要是支链氨基酸转移酶、氢过氧化物裂解酶和己糖激酶。影响发酵后期风味的关键酶主要是芳香族氨基酸转移酶、酯酶和醇酰基转移酶。(3)基于酸鱼特征风味物质与风味前体以及关键酶的关系,筛选特征风味物质可能的形成途径,应用宏基因组测序技术从基因层面预测参与酸鱼特征风味形成的关键微生物。通过KEGG通路注释,发现代谢类通路占比最高,达61.9%以上。在碳水化合物代谢通路中,注释到糖酵解/糖异生途径的基因数最为丰富,其次是柠檬酸循环和氧化磷酸化。在氨基酸代谢通路中,芳香族氨基酸和支链氨基酸代谢的相对丰度均随着发酵进行逐渐增加,在发酵第四周分别达到20.1%和12%。在脂质代谢通路中,磷脂代谢和甘油酯代谢途径所占比例达到50%以上。通过对酸鱼特征风味形成途径中的关键催化酶进行物种注释,发现细菌属对酸鱼风味形成起主要作用。参与发酵前期碳水化合物和脂肪代谢风味形成的微生物主要有葡萄球菌属、片球菌属、乳杆菌属、肠球菌属、巨型球菌属、微小杆菌属、弧菌属、库克氏菌属、酵母属和念珠菌属;参与发酵后期芳香氨基酸代谢风味和酯类风味形成的微生物主要有异常威克汉姆酵母、红酵母属、德巴利氏酵母属、葡萄球菌属、明串珠菌属、肠球菌属、片球菌属、乳杆菌属和弧菌属。(4)为了定向调控酸鱼特征风味,需要进一步明确参与酸鱼特征风味形成的关键微生物在整个发酵过程中的演替规律。采用高通量测序技术对酸鱼发酵过程中产生风味的关键微生物群落的动态变化进行分析,发现与风味相关的葡萄球菌属相对丰度从原料样品的1.95%急剧增加到12.52%(发酵一周),但随着发酵进行迅速下降至1.88%(发酵四周)。而与风味相关的乳杆菌属和巨型球菌属在发酵初期为优势菌属,相对丰度分别占45.74%和31.99%。在发酵后期,乳杆菌属的相对丰度达到71.57%。真菌中参与碳水化合物代谢的酵母属在发酵第一周相对丰度达到88.83%。发酵三周后,念珠菌属成为主要优势菌属(96.59%),而异常威克汉姆酵母在发酵第四周占主导优势(32.51%)。然而,与风味产生相关的乳球菌属、明串珠菌属、肠球菌属和弧菌属的相对丰度在接种发酵过程中明显受到抑制。进一步分析影响关键微生物的环境因素,结果表明,对细菌群落变化贡献较大的环境因子主要是pH值,而水分含量对真菌群落变化影响较大。通过分析微生物的相互作用发现,乳杆菌属与魏斯氏菌属和弧菌属等几种风味细菌属呈负相关,葡萄球菌属与酵母属和微小杆菌属两两正相关。本论文确定了酸鱼不同发酵阶段的特征风味物质、风味前体物质和关键酶之间的关系,明确了酸鱼特征风味物质在整个过程中的代谢规律,预测了特征风味物质可能形成途径中的关键微生物,探明了发酵过程中产生风味物质的关键微生物的演替规律,揭示了发酵酸鱼特征风味形成与微生物之间的关系,能够为定向调控酸鱼风味提供理论指导。