植物在生长过程中,需要从复杂的微生物环境中获取营养物质,但它们却很少被真菌感染,因为它们在进化过程中形成了独特的抗菌方式,包括多类抗病抑菌作用的次生代谢产物和蛋白质。其中,抗真菌蛋白在植物防御体系中扮演非常重要的角色。本课题的目的是从南瓜籽中分离得到一种具有抗真菌活性的蛋白,并对其理化性质,生物活性等进行研究,从而为克隆其基因、研究其机理,并在农业、医学领域的应用奠定基础。在试验部分中,首先对比了低温恒温搅拌浸提法、组织匀浆法和超声波细胞粉碎浸提法三种方法提取得到总蛋白含量的高低,最终选择了组织匀浆法。利用组织匀浆法提取宝库一号(裸仁)、银辉一号、雪域二号,金辉二号四种南瓜籽的总蛋白,并对比这四种南瓜籽的总蛋白含量,分子量分布以及抗真菌活性。最终选择宝库一号南瓜籽为本试验的原料。对宝库一号南瓜籽用10mmol/L pH7.0(含0.15mol NaCl,10mmol巯基乙醇)磷酸缓冲液进行抽提,经过匀浆、离心、硫酸铵分级沉淀、透析等步骤及抗真菌活性测定,确定40%～55%和55%～95%硫酸铵沉淀的组分活性较强,可用于色谱分离纯化;活性组分用自动层析仪阳离子交换柱SP-Sepharose(10/30)进行色谱分离,并对流速和洗脱液的离子强度进行了考察,最终得到柱层析的最优条件为1Ommol,pH=4.5(含NaCl 50mmol)的醋酸缓冲液为洗脱剂,流速为0.8mL/min。以此条件对以上两个组分进行色谱分离,分别收集到3个组分和4个组分,筛选出活性较强的组分SP2、SP3和SP5、SP6,并对其进行SDS-PAGE电泳检测,发现SP3组分呈现单一条带,然后对SP3组分进行二次纯化,透析,冻干。利用SDS-PAGE电泳分析最后得到的SP3蛋白样品,为清晰的单一条带,直接通过凝胶分析软件quantity one计算得到分子量为14.88kDa,利用标准品分子量与迁移率得到的标准曲线计算得到的分子量为14.84kDa,纯度约为87.3%。并对蛋白条带挖点,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,得到了该抗菌蛋白相应的肽质量指纹谱(PMF),通过Mascot比对NCBIn蛋白数据库,确定它为新的抗真菌蛋白。对SP3蛋白进行氨基酸组成分析,得出SP3富含谷氨酸和精氨酸,分别占总量的16.4%和17.4%。本试验分析了 SP3蛋白的一些生物活性:1)抗真菌活性及抗真菌半抑制浓度(IC50):SP3蛋白对黄瓜枯萎病菌、大豆灰斑病菌、链格孢菌都有较强的抑制活性,测定了 SP3蛋白对这三种真菌的IC50值,分别为16.64μmol/L、20.91μmol/L、21.22μmol/L。2)抗细菌活性:SP3蛋白对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌具有一定的抑制作用,但对大肠埃希氏菌的抑制作用很弱。3)对温度敏感性测定:SP3蛋白在50℃以下,其抗菌活性比较稳定。4)对pH敏感性的测定:SP3蛋白在pH为5.0～9.0之间的缓冲体系下,能较好的保持其抗菌活性。5)对紫外线敏感性的测定:SP3蛋白在紫外照射12h内都能较好的保持其抗真菌活性。6)含糖量测定:SP3蛋白的含糖量很低,不属于糖蛋白,其中含有的糖类可能是南瓜籽本身带有的糖类化合物。7)抗氧化性:清除基DPPH自由基的能力为Vc>SP3>Ve,其IC50为31.8μg/mL。8)类SOD活性:SP3蛋白的单位SOD活性为24.31U/mg。