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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是发生于老年和老年前期、以进行性认知功能障碍及行为损害为特征的中枢神经系统变性疾病。神经毒性β淀粉样蛋白(βamyloid,Aβ)在脑内的聚集和异常沉积是AD发病的关键环节,针对Aβ神经毒性治疗AD成为近年来AD研究热点之一。脑内Aβ聚集和沉积源于Aβ产生和/或清除失衡,晚发性AD脑内Aβ沉积与Aβ清除障碍密切相关。脑内Aβ的清除途径主要包括细胞外降解、细胞内吞和转运清除出脑,外流转运绝大部分是经血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)途径实现。晚发性AD患者脑内出现的Aβ沉积可能与BBB上Aβ转运和/或脑内降解障碍有关。目前研究发现,低密度脂蛋白受体相关蛋白(Low-density lipoprotein receptor-relatedprotein,LRP)与AD发病密切相关。脑内表达的LRP主要有两种亚型,即LRP-1与LRP-2。LRP-1的生理功能目前尚不十分清楚。体外实验发现,细胞表面的LRP-1能够与结合型Aβ结合。AD患者LRP-1阳性表达的脑微血管明显减少,并且与AD患者脑内局部Aβ1-40与Aβ1-42的沉积相关,由此提出脑内βB经BBB的外流转运可能是由脑微血管内皮细胞上的LRP-1介导。LRP-1很可能就是BBB上参与脑内Aβ1-40外流清除的转运体。1999年以来Aβ主动免疫或被动免疫治疗APP转基因小鼠发现,Aβ免疫治疗能够促使脑内Aβ外流转运,并减少脑内老年斑形成,由此提出Aβ“外周沉积”的治疗策略。但是,Aβ免疫治疗Ⅱ期临床试验过程中部分受试者出现了严重的中枢神经系统炎症表现。那么,根据BBB上可能存在的Aβ1-40外流转运途径,是否能寻找其他不经BBB通透、但能在外周与血浆Aβ1-40结合的物质以降低血浆游离型Aβ1-40的浓度,从而改变脑-血液之间Aβ1-40的动态平衡,促进脑内Aβ1-40的大量外流,达到Aβ“外周沉积”的效果,同时又不会出现Aβ免疫治疗可能伴随的中枢神经系统炎症反应呢?本研究首先通过RT-PCR和Western Blot检测脑微血管内皮细胞株LRP-1的表达。然后通过人脐静脉内皮细胞与星形胶质细胞共培养建立的BBB体外模型以及小鼠体内实验观察脑内Aβ1-40经BBB外流转运的特点,并通过抗LRP-1抗体、LRP-1受体拮抗剂——受体相关蛋白(receptor associated protein,RAP)和Aβ1-40吸附剂凝溶胶蛋白干预,进一步探讨LRP-1与脑内Aβ1-40经BBB外流转运的关系,以及外周使用凝溶胶蛋白对脑内Aβ1-40外流转运的影响,初步探讨“外周沉积”治疗策略的可行性。第一部分血脑屏障体外模型的建立与评价目的:建立一种相对简便而可靠的血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)体外模型。方法:将人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)与小鼠星形胶质细胞(astrocyte,As)进行共培养建立BBB体外模型。电镜技术观察该模型的形态特征,跨内皮细胞电阻抗测定观察模型的物理屏障功能,14C-蔗糖与125I-牛血清白蛋白经该模型的通透性测定观察模型的屏障功能。结果:共培养后HUVEC间出现了紧密连接,第7天跨内皮细胞电阻达(267±24)Ω/cm2。BBB特征酶γ-谷氨酰转肽酶含量为(12.41±1.71)U/mg蛋白,与第2代HUVEC(2.76±1.00 U/mg蛋白)的差异有统计学意义(P<0.01)。共培养和单层培养HUVEC对14C-蔗糖的通透系数分别为(0.93±0.32)×10-3、(8.28±3.37)×10-3cm/min,差异有统计学意义(P<0.01)。模型对125I-牛血清白蛋白具有良好的限制通透作用。第二部分脑内β淀粉样蛋白1-40经血脑屏障体外模型的外流转运目的:检测脑微血管内皮细胞株上LRP-1的表达,并观察LRP-1与脑侧β淀粉样蛋白1-40经BBB体外模型外流转运的关系。方法:RT-PCR和Western Blot法检测共培养7d的HUVEC、单独培养的第2代HUVEC、小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3和人第3代As LRP-1 mRNA及蛋白水平的表达。分别在0min、10min、20min、30min、60min和120min 6个时间点观察外源性Aβ1-40(50nmol/L)经BBB体外模型(HUVEC/As共培养)的转运,以及As侧加RAP(200nmol/L)或抗LRP-1抗体(60ug/ml)预孵和HUVEC侧加入凝溶胶蛋白(9ug/ml)对Aβ1-40经BBB体外模型转运的影响。ELISA法检测各组转运实验后培养液中Aβ1-40的浓度。结果:共培养、单独培养的第2代HUVEC和bEnd.3均有LRP-1mRNA的表达。单独培养的As无LRP-1 mRNA的表达。共培养与单独培养的第2代HUVEC均存在LRP-1蛋白水平的表达。共培养和单独培养的As均无LRP-1蛋白水平的表达。Western blot的结果与RT-PCR结果一致。随转运时间延长,As侧Aβ1-40浓度逐步降低,20min时由(200.12±15.01)pg/ml降低到(99.07±11.92)pg/ml。2h后浓度为(44.92±7.40)pg/ml。RAP预处理后,各时间点As侧Aβ1-40浓度与对照组的差异有显著性(P<0.05)。LRP-1预处理后,各时间点As侧Aβ1-40浓度与对照组的差异有显著性(P<0.05),与RAP组的差异无显著性(P>0.05)。凝溶胶蛋白组各时间点As侧Aβ1-40浓度与对照组的差异有显著性(P<0.05)。Aβ1-40经BBB的外流转运不影响BBB的屏障功能。第三部9-LRP-1与小鼠脑内β淀粉样蛋白1-40外流转运的体内实验目的:通过体内实验观察LRP-1与小鼠脑内Aβ1-40外流转运的关系。方法:RAP、抗LRP-1抗体或生理盐水脑内注射(RAP 5umol/L;抗LRP-1抗体60ug/ml;生理盐水)。每点0.3ul。隔天1次,共2w。分别于注射前、第8d、第15d取血浆与脑匀浆,ELISA法测定Aβ1-40含量。凝溶胶蛋白(0.6mg/kg体重/d,隔天1次,共3w)和等量生理盐水腹腔注射。分别于注射前、第12d、第22d取血浆与脑匀浆,ELISA法测定Aβ1-40含量。空白对照组:在相应时间点血浆与脑匀浆(注射前、第8d、第15d),ELISA法测定小鼠血浆及脑匀浆Aβ1-40含量。结果:抗LRP-1抗体脑内注射后,dO、d8和d15脑匀浆Aβ1-40水平分别为(47.29±6.80)pg/g组织、(69.03±9.06)pg/g组织、(86.63±7.78)pg/g组织,差异有显著性(P<0.05)。并且d0、d8和d15脑匀浆Aβ1-40水平与生理盐水脑内注射组或空白对照组的差异均有统计学意义(P<0.05)。LRP-1脑内注射后,dO、d8和d15血浆Aβ1-40水平分别为(14.67±3.37)pg/ml、(8.59±1.32)pg/ml、(4.56±0.89)pg/ml。组间差异有显著性。并且d0、d8和d15血浆Aβ1-40水平与生理盐水脑内注射组或空白对照组的差异均有统计学意义(P<0.05)。RAP脑内注射后,dO、d8和d15脑匀浆Aβ1-40水平分别为(40.38±7.93)pg/g组织、(57.86±8.85)pg/g组织、(74.73±8.54)pg/g组织。脑匀浆Aβ1-40水平与生理盐水脑内注射组或空白对照组的差异均有统计学意义(P<0.05),与LRP-1组的差异无统计学意义(P>0.05)。RAP脑内注射后,d0、d8和d15血浆Aβ1-40水平分别为(16.21±2.71)pg/ml、(7.56±0.85)pg/ml、(5.26±1.65)pg/ml。血浆Aβ1-40水平与生理盐水脑内注射组或空白对照组的差异均有统计学意义(P<0.05),与LRP-1组的差异无统计学意义(P>0.05)。凝溶胶蛋白腹腔注射后,d0、d12和d22脑匀浆Aβ1-40水平分别为(45.33±7.63)pg/g组织、(32.28±4.24)pg/g组织、(24.17±3.73)pg/g组织。脑匀浆Aβ1-40水平与生理盐水腹腔注射组或空白对照组的差异均有统计学意义(P<0.05)。凝溶胶蛋白腹腔注射后,dO、d12和d22血浆Aβ1-40水平分别为(13.18±2.03)pg/ml、(23.60±3.35)pg/ml、(28.93±3.57)pg/ml。血浆Aβ1-40水平与生理盐水腹腔注射组或空白对照组的差异均有统计学意义(P<0.05)。空白对照组、生理盐水脑内注射组和生理盐水腹腔注射组d0、d8(12)以及d15(22)脑匀浆Aβ1-40水平的差异均无统计学意义(P>0.05)。空白对照组、生理盐水脑内注射组和生理盐水腹腔注射组内以及组内d0、d8(12)和d15(22)血浆Aβ1-40水平的差异均无统计学意义(P>0.05)。结论1.HUVEC与小鼠As共培养建立的BBB体外模型能较好模拟在体BBB类似的结构与屏障功能。HUVEC的原代培养相对简单,容易达到共培养对细胞纯度的要求。培养液中加入氢化可的松后,HUVEC增殖迅速,节省构建模型所需要的时间,同时加入激素也有助于BBB体外模型的生物学特性的维持。2.通过RT-PCR和Western Blot方法检测到脑微血管内皮细胞株上LRP-1的表达。50 nmol/L外源性Aβ1-40经BBB体外模型外流转运的半衰期在20min左右。而此浓度与3~4月龄β淀粉样前体蛋白转基因小鼠脑内Aβ1-40浓度相当,由此提示,生理状态下BBB具有强大的清除脑内Aβ1-40的能力。抗LRP-1抗体能够抑制Aβ1-40的外流转运,RAP同样能抑制脑侧高浓度Aβ1-40的外流转运,其抑制能力与抗LRP-1抗体相当。外周使用凝溶胶蛋白促进脑侧外源性Aβ1-40的外流转运。3.小鼠脑内注射抗LRP-1抗体后,脑内Aβ1-40负荷增加,同时出现血浆Aβ1-40浓度的降低,提示脑内注射抗LRP-1抗体能够抑制脑内Aβ1-40的外流转运。脑内注射RAP后,脑内Aβ1-40负荷增加,同时出现血浆Aβ1-40浓度的降低,提示脑内注射RAP能够抑制脑内Aβ1-40的外流转运,并且其抑制的程度与抗LRP-1抗体脑内注射相当。外周使用Aβ1-40吸附剂(凝溶胶蛋白)后,脑内Aβ1-40负荷降低,同时出现血浆Aβ1-40浓度的升高,提示腹腔注射凝溶胶蛋白能够促进脑内Aβ1-40的外流转运。