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骨质疏松表现为较低的骨密度,是一种容易导致骨折的全身性骨骼疾病,严重影响公众健康,与骨骼发育有密切关系。本研究室早期通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析等,发现STAT1基因与骨质疏松密切相关,但不清楚STAT1基因在体调控骨骼发育而导致骨表型改变的作用机制,所以本研究结合分子遗传学手段,选择斑马鱼模型进行在体研究,进一步揭示骨骼发育的分子调控机制,对骨质疏松症的预防、诊断、治疗以及药物开发都有重要意义。斑马鱼与人类在骨骼发育过程中的基因、信号通路有高度同源性,且STAT1基因进化上较为保守,人类STAT1基因的两个不同剪接体STAT1-alpha和STAT1-beta对应于斑马鱼两个不同基因stat1a和stat1b,研究发现stat1a在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且,与其他动物模型相比,斑马鱼个体小、幼鱼通体透明,利于骨骼发育的观察。本文主要通过CRISPR/Cas9基因打靶技术,在斑马鱼stat1a基因上设计合适的打靶位点,将体外合成的特异性sgRNA(终浓度20ng/μL)和Cas9-mRNA(终浓度300 ng/μL)显微共注射进斑马鱼一细胞内,并通过活性检测证实了所选位点的有效性。对F0代斑马鱼提取基因组DNA后进行T7E1酶切检测以及Sanger测序,成功筛选到2条stat1a基因突变的F0代斑马鱼。在F1代受精后20天、30天和47天,随机挑取两个突变体的F1代斑马鱼和野生型斑马鱼各10条,测量其长度,发现突变体F1代斑马鱼要比野生型生长速度更快。结果与小鼠stat1-/-敲除研究发现骨密度与骨量增加一致,提示stat1可能通过抑制成骨细胞生成影响骨骼发育。目前,已经从F2代胚胎中鉴定到stat1a突变体纯合子。用Phyre软件预测F1代突变体STAT1蛋白质空间结构时发现,其二级结构的某些保守结构域位点发生改变。STAT1蛋白的V638和S639处是同源二聚体界面,对应于F1代突变体的这两个氨基酸位点,V630和S631却不再是同源二聚体接触面。可能是由于stat1a基因突变影响STAT1同源二聚体的结合,影响骨骼的生长发育,从而导致斑马鱼生长更快。为进一步分析stat1a基因敲除后的变化,利用不同浓度STAT1抑制剂磷酸氟达拉滨(Fludarabine)处理斑马鱼胚胎10天,发现随浓度增加死亡率也随之增加。低于5μg/mL浓度组的死亡率低于10%,10μg/mL、20μg/mL以及40μg/mL浓度组死亡率达到30%-40%,而50μg/mL浓度组从处理第5天开始,死亡率接近70%。从处理第3天开始,实验组斑马鱼陆续出现轻微或严重畸形,且随处理浓度增大,畸形鱼的死亡率增加,且死亡的斑马鱼绝大部分是畸形鱼。氟达拉滨可抑制STAT1表达,而STAT1抑制成骨细胞分化,出现畸形可能是由于STAT1的抑制引起破骨细胞、成骨细胞生理功能失衡而导致骨骼发育异常,最终产生骨表型的改变。