植物RNA病毒常常伴随有小的卫星RNA。卫星RNA是一类小的非编码RNA,基因组大小为200-1500nt,通常不编码蛋白,完全依赖于辅助病毒来完成复制、包被、移动和传播,且和其辅助病毒的基因组不存在序列同源性。部分卫星RNA可以影响辅助病毒在寄主植物上诱发的症状,多数为减轻,少数会加重寄主症状。传统理论认为卫星RNA是通过与辅助病毒竞争复制酶,减少了辅助病毒的复制,从而减轻了寄主症状。然而,传统理论不能解释卫星RNA在减轻辅助病毒诱导症状的同时,部分辅助病毒复制量不受影响的现象。由此推测,卫星RNA可能存在其它途径来减轻辅助病毒诱导的症状。RNA沉默(或称为RNAi)是一种广泛存在于真核生物中,由小RNA介导的、以序列特异性的方式抑制或破坏靶标基因表达,在DNA或转录水平上的调控机制。RNA沉默可以调控基因的表达、修饰DNA和特异染色体区域组蛋白的表观遗传、防御转座子和病毒等核酸的入侵。病毒为了成功侵染寄主,也进化了相应的反防卫机制。大部分是通过编码基因沉默抑制子(viral suppressor of RNA silencing, VSR)蛋白结合病毒的siRNA,阻止RNA沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)的形成,抑制病毒基因组的降解。基于RNA沉默具有调控植物正常生长发育和防御病毒的功能、VSR具有干扰RNA沉默反防卫机制、多数卫星RNA在复制过程中伴随着巨量的卫星RNA siRNA产生的三个依据,本文提出了以下假说来解释卫星RNA减轻病毒对寄主植物所诱导的症状。1)病毒通过其产生的VSR干扰寄主植物的miRNA代谢途径,从而致病；2)卫星RNA通过其产生的巨量siRNA捕获并饱和大部分的VSR,减少VSR干扰寄主植物的miRNA代谢途径,减轻病毒对寄主植物诱导的症状。本文通过对烟草、辅助病毒CMV和Y-卫星RNA(Y-Satellite RNA, Y-Sat)组成的模式系统进行研究,验证了以上假说。模式系统选用CMV亚组Ⅱ的病毒株Q-CMV作为负对照。Y-Sat被选用于本研究,是因为卫星RNA的研究中以对CMV卫星RNA研究最多,而Y-Sat在CMV卫星RNA中具有代表性,可以导致本氏烟和普通烟等的斑驳黄花,方便了对病毒侵染过程的检测。验证实验分为两个方面,1)应用GUS报告基因监测在有无卫星RNA伴随侵染时P19和2b两种VSR的活性；2)应用miRl68表达量易受VSR诱导的特性,监测在有无卫星RNA伴随侵染时VSR对miR168的影响。验证实验获得了以下几个方面的结果：1. hpGUS可以有效的沉默GUS,而TBSV的P19和SD-CMV编码的2b两个VSR构件都可以干扰hpGUS介导的GUS沉默。实验采用农杆菌浸润法将GUS+hpGUS、GUS+hpGUS+P19或2b等构件转入本氏烟中进行瞬时表达,比较有无VSR共浸润时GUS蛋白量的变化。并通过GUS染色和GUS的相对酶活性测定分析了P19和2b的活性。实验成功模拟了植物内源的小RNA代谢途径,检验了P19和2b对hpGUS介导的GUS沉默的影响；实验结果与以前报道的VSR可以干扰hpRNA介导RNA沉默的实验结果相吻合。2. Y-Sat影响了VSR干扰RNA沉默的功能。在野生型本氏烟上进行Q-CMV和Q-CMV+Y-Sat感染实验,然后瞬时表达GUS、hpGUS和P19或2b等构件。在只有Q-CMV感染时,P19和2b都可以干扰hpGUS介导的GUS沉默；在Q-CMV+Y-Sat感染的样品中,P19和2b对GUS的沉默却被削弱了；在只有GUS构件时,存在GUS基因的共抑制现象(另一种RNA沉默形式)；在GUS+P19或GUS+2b共浸润的样品中,共抑制现象明显减少,而在有Y-Sat感染时,即使有P19或2b构件的存在,共抑制水平仍然很高。通过对GUS mRNA的Northern印迹分析,GUS mRNA的量与GUS蛋白的量正相关,证实了沉默发生在RNA水平。上述结果证明了Y-Sat能影响VSR干扰RNA沉默的功能,说明VSR对植物内源小RNA介导的沉默途径的影响能被卫星RNA削弱。3. Y-Sat导致的斑驳黄化对实验体系无明显影响。CMV+Y-Sat共同侵染的本氏烟植株出现了斑驳黄化症状,影响了植物的正常光合作用,也可能对整个实验体系产生干扰。为了排除Y-Sat导致的斑驳黄化对实验体系的影响,实验用CHLI突变体mCHLI转化本氏烟,获得不再出现斑驳黄化植株。应用mCHLI转基因本氏烟F2代,进行了Q-CMV或Q-CMV+Y-Sat的侵染,然后瞬时表达GUS、.hpGUS和P19或2b、GFP等构件。实验结果表明,VSR影响了hpGUS介导的GUS沉默,在有Q-CMV+Y-Sat共侵染的样品中,Y-Sat干扰了VSR的功能。实验结果与在野生型本氏烟中所得结果一致,说明了Y-Sat导致的斑驳黄化对实验体系无明显影响。4.在Y-Sat感染且有GUS+hpGUS+VSR共浸润的样品中,GUS仍被高度沉默的现象不是由于hpGUS产生更多siRNA所致。在用GUS、hpGUS和P19或2b进行共浸润时,Q-CMV+Y-Sat共同感染比Q-CMV单独感染的样品产生了更高水平的GUS沉默。这种现象的出现有可能是由于Y-Sat干扰了VSR的功能,也有可能是由于hpGUS产生了更多的siRNA,从而介导了更多的GUS沉默。为了排除后一种可能性,实验设计了hpGUS siRNA的Northern印迹检测分析。结果显示,在感染Q-CMV+Y-Sat样品中,hpGUS siRNA的量并没有增加,排除了hpGUS产生更多siRNA介导更多的GUS沉默的可能性。5.Y-卫星RNA siRNA捕获了VSR,削弱VSR对hpGUS介导的GUS沉默途径的影响。实验应用P19抗体进行RNA-免疫捕获分析,先对植株感染Q-CMV或Q-CMV+Y-Sat处理,再进行GUS、hpGUS、P19共浸润,后采用P19抗体沉淀P19蛋白复合体,并从沉淀复合体中分离RNA,通过Northern印迹分析与P19结合的hpGUS siRNA、Y-Sat siRNA量。结果显示,在Q-CMV感染的样品中,有部分hpGUS siRNA与P19结合；而在Q-CMV+Y-Sat感染的样品中,与P19结合的hpGUS siRNA较少,大部分的P19和Y-Sat siRNA结合在一起。结果说明P19是通过结合hpGUS siRNA来干扰hpGUS介导的GUS沉默；Y-Sat siRNA通过饱和VSR,增加游离的hpGUS siRNA,介导了较高水平的GUS沉默。实验结果进一步表明卫星RNA是通过产生的大量siRNA捕获VSR,从而削弱VSR对寄主小RNA介导的对内源基因调控的干扰。6. Y-Sat可以削弱CMV编码的2b对miR168的诱导。miRNA在植物生长发育过程中起着至关重要的作用。有报道证实了VSR可以诱导miR168的表达量,miR168负调控AGO1mRNA,影响了植物miRNA代谢途径中关键蛋白AGO1的量。为了证实VSR对植物内源miRNA的影响是病毒致病的主导因素,且卫星RNA可以减少VSR对miRNA代谢的影响,本实验以miR168的表达量为指示,检测了感染CMV亚组Ⅱ(Q-CMV)和CMV亚组Ⅰ(Fny-CMV)及与Y-Sat的本氏烟样品中miR168的表达量。结果显示,Q-CMV和Fny-CMV都可以诱导miRl68的表达量；当有Y-Sat共同感染时,miR168的表达量明显减少,感染植株症状减轻；Fny-CMV可以引起相对于Q-CMV而言更高的miR168累积,感染植株也产生了更严重的症状。结果说明Y-Sat可以削弱CMV编码的2b对miR168的诱导,且miR168的表达量高低与植物发病程度紧密相关。实验用半定量RT-PCR检测CMVRNA4a,发现Y-Sat在削弱2b对miR168诱导的同时,编码2b蛋白CMV RNA4a的量有轻微的减少,导致miR168表达量减少的原因部分可能是由于Y-Sat共同感染时2b量的减少。7. Y-Sat显著的抑制了P1/HcPro对miR168的诱导。本文应用了由烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus, TEV)编码的VSR P1/HcPro转基因普通烟(N. tabacum)体系对miR168的表达量进行了检测分析。实验结果显示,在P1/HcPro转基因普通烟中,miR168被明显的诱导,同时出现茎基部弯曲生长的表现型；在Q-CMV+Y-Sat共同感染转基因普通烟中,miR168的表达水平显著降低,茎基部弯曲生长的表现型基本消失。实验结果说明,植物病毒VSR通过影响植物内源的miRNA代谢途径而致病,而卫星RNA通过干扰VSR,削弱病毒的致病性,减轻病毒诱导的症状。以上7个结论,从小RNA的水平验证了植物病毒卫星RNA弱化辅助病毒致病机理的假说,证明了1)病毒通过其产生的VSR干扰寄主植物的miRNA代谢途径,从而致病；2)卫星RNA通过其产生的巨量siRNA捕获并饱和大部分的VSR,减少VSR干扰寄主植物的miRNA代谢途径,减轻病毒对寄主植物诱导的症状。卫星RNA主要存在于植物病毒,DI RNA主要存在于动物病毒。假说在植物和病毒卫星RNA上面得到了部分验证,作者推断假说还适用于动物和病毒DI RNA。部分动物病毒编码的VSR,也具有结合小RNA的特征,动物病毒的DI RNA,在复制过程可能也会产生大量的siRNA,饱和VSR,干扰VSR的致病性。