长期以来，化石燃料一直作为人类能源的主角支撑着世界经济的发展。然而，随着科技进步、人口增多、工业化程度增高，能源需求已经显得捉襟见肘了。而且这些不可再生的燃料的使用对自然环境会造成不同程度的污染和破坏。随着能源危机、粮食问题和环境恶化等问题的日趋凸显，生物质能源成为当今国际上新能源开发的热点，被誉为“绿色”能源。 燃料乙醇是未来可再生能源的主流，是一种良好的液体燃料。乙醇的热值仅为汽油的三分之二，但由于含氧元素，是燃油氧化处理的增氧剂，使石油增加内氧，燃烧充分，达到节能和环保目的；乙醇具有极好的抗爆性能，代替传统MTBE作汽油抗爆、增氧添加剂，可避免产生致癌物质；在“新配方汽油”中，乙醇还可以经济有效地降低芳烃、烯烃含量，降低炼油厂的改造费用；更重要的是乙醇是太阳能的一种表现形式，在整个自然界这个大系统中，乙醇的整个生产和消费过程可形成无污染和非常清洁的闭路循环过程，永恒再生，永不枯竭。燃料乙醇虽然是很好的替代能源，但目前乙醇的规模化生产还存在许多需要改革的问题。首先，粮食危机日趋严重，粮食储备短缺。其次，酿酒酵母的乙醇产率普遍偏低，无法满足工业化大生产的需求。因此高产乙醇的微生物的选育以及非粮为原料燃料乙醇的发酵生产成为近几年的研究热点之一。 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是工业上用于生产乙醇的传统菌种，历史悠久。因其乙醇耐受性好，工业应用广泛，发酵工艺成熟，生物安全性好，再加上它的典型模式生物特性，因此在乙醇生物质能源研究中备受科学家的青睐，是生产燃料乙醇的理想菌株。在燃料乙醇的发酵生产中，最为重要的因素就是优良高产酿酒酵母菌株的选育。而成功选育一株高产、耐高温、乙醇耐受性好、能高效利用底物及利用各种不同底物(秸秆、纤维素类、淀粉类等)的酵母菌株，不仅可以大幅提高酿酒酵母乙醇的发酵能力，而且还可以大大降低生产企业的成本，提高社会经济效益。为了这一目的人们正通过各种育种手段，从不同方面、不同角度来改进酿酒酵母的生产性能。而分子育种是在分子生物学指导下一种自觉的、可预先设计和控制的育种新技术，是最新最有前途的一种育种新技术。基因敲除是一种反向的遗传学研究方法，是20世纪80年代后发展起来的一种新型的分子育种手段，通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失，可以改变细胞的遗传特性，从而达到微生物育种的目的。Cre/loxP系统属于传统的同源重组载体，对研究酿酒酵母未知基因的功能是一种十分有效的方法。该系统还可以进行标记挽救，使得在同一酵母菌株中敲除和表达各种不同的基因时不需要更改抗性标记，解决了同时修饰许多基因时，可用抗性筛选标记有限的难题。 在乙醇代谢过程中，酿酒酵母利用葡萄糖通过糖酵解作用生成丙酮酸，然后在丙酮酸脱羧酶的作用下还原为乙醛，乙醛在乙醇脱氢酶的催化下生成乙醇，在乙醛脱氢酶的作用下生成乙酸。酿酒酵母中主要有五个基因(ADH1-ADH5)编码与乙醇代谢相关的乙醇脱氢酶系，其中Adh1p、Adh3p、Adh4p和Adh5p这四种乙醇脱氢酶在厌氧发酵过程中还原乙醛生成乙醇；而当环境中缺少作为碳源的葡萄糖时，受葡萄糖阻遏的ADH2基因起始表达，生成Adh2p开始催化乙醇作为碳源进行生长：同时ALD基因编码的乙醛脱氢酶ACDH启动催化乙醛氧化为乙酸的生化反应，从而减少乙醛生成乙醇的量。SNF1基因编码的Snf1p是一个依赖于AMP激活的丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶，对受到葡萄糖阻遏效应的基因的转录具有重要的调控作用，对Adh2p和ACDH的合成也是至关重要的。因此，在酿酒酵母中敲除SNF1基因有助于酿酒酵母乙醇的生物合成。 该论文利用Cre/loxP筛选标记，成功地构建了SNF1双倍体缺陷型菌株YS2-△snf1::loxp-kan-loxp，并对突变株与原始菌株YS2的生物学特性进行了比较研究。 首先利用LFH-PCR的方法和Cre/loxP系统中的pUG6质粒合成了两端各带有333 bp和323 bp与SNF1序列上下游同源的SNF1基因敲除组件。将该敲除组件用LiAc/SS载体DNA/PEG高效酵母转化法转化至酿酒酵母YS2，获得被loxP-kan-loxP序列组件替换而产生kanr的阳性克隆子。然后将质粒pSH65转入阳性克隆子并在YPG诱导培养基中诱导表达Cre酶切除kan基因，进而通过传代丢失质粒pSH65后得到SNF1单倍体缺陷型菌株。重复转化敲除组件实现另一条等位基因的敲除，得到SNF1双倍体缺陷型菌株YS2-△snf1::loxp-kan-loxp。 突变菌株YS2-△Asnf1::loxp-kan-loxp构建成功后，对其生长情况、遗传稳定性和酒精耐受性进行了检测，发现YS2-△shf1::loxp-kan-loxp与YS2相比，生长周期和菌落大小、形态相似，没有表现出明显差异。对YS2-△adh2-adh1连续传代(>10次)，随机筛选20个单菌落进行重组鉴定，均为阳性结果，没有发现回复突变。说明所构建的菌株YS2-△snf1::loxp-kan-loxp的突变发生在染色体水平，遗传性状较稳定，无需在培养基中添加其它物质便可以维持其正常生长。YS2-△snf1::loxp-kan-loxp相对出发菌株酒精耐受性没有显著差异，但在4％～8％的酒精浓度之间酒精耐受性更好些，稍显优越。 对突变菌株YS2-△snf1::loxp-kan-loxp进行厌氧发酵试验，DNS法测定发酵液残糖量，气相色谱分析其乙醇、乙酸生成量。实验结果表明该突变株的乙酸产量较出发菌株YS2降低了10.05％，乙醇产量提高了8.74％，说明SNF1基因的缺失对乙醛脱氢酶启动的催化乙醛氧化为乙酸的生化反应起到了一定的阻断作用，从而使乙醇的生成量有所增加；残糖量试验表明在培养基中葡萄糖消耗殆尽后，突变株相对于出发菌株而言并没有利用乙醇作为碳源，乙醇产量保持稳定未有下降，这进一步说明突变株YS2-△snf1::loxp-kan-loxp在一定程度上阻遏了ADH2基因的表达活性，对防止乙醇再次被利用起到了一定的作用。