论文部分内容阅读
基因组的精准编辑,因其能够安全的对基因组进行修饰,正在成为研究基因功能、进行疾病治疗以及动物新品种培育的重要手段。CRISPR/Cas9技术的开发,使得科学家可以更加简便高效地对目的基因进行修饰。CRISPR/Cas9系统中,Cas9核酸酶在单链导向RNA(sgRNA)的引导下,可以对目标基因组位点进行靶向识别,引发DNA的双链断裂(DSBs)。DNA的双链断裂修复主要有两个途径:非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HDR)。经典的NHEJ被认为是一种容易出错的DSBs修复途径,通常导致目标位点的随机插入或删除(indels),但其效率远远高于HDR。而后者在单碱基替换、目的片段敲入和敲除等精确编辑领域的应用更为广泛。
近年来的研究发现,有一种特殊的NHEJ修复方式,在Cas9核酸酶导致DNA的双链断裂修复时,游离的两端DNA不经过消化和修饰,而是由DNA连接酶直接将断裂切口连接。这种修复方式被称为精确NHEJ修复(Accurate-NHEJ,简称acNHEJ)。与经典的NHEJ通路不同,acNHEJ修复是精确和可预测的。研究人员发现acNHEJ几乎和经典的NHEJ一样高效。然而,acNHEJ介导的精确片段删除的报道长度仅在100bp以内,对于长片段的acNHEJ删除未见报道。
为了验证acNHEJ修复方式可以介导长片段精确删除,同时应用于CRISPR/Cas9介导的基因精确删除研究。本研究开发了一种可专门用于富集双sgRNA-Cas9介导的基于acNHEJ修复的精确删除阳性细胞的通用型报告载体系统(Accurate NHEJ-based Universal Surrogate Reporter, acNHEJ-USR)。该报告载体系统具有自我切割和自我修复的特点,将报告载体与靶向目的基因的双sgRNA打靶载体共转至细胞内,然后对细胞进行嘌呤霉素药物筛选5天以后,即可高效富集发生acNHEJ介导的精确删除细胞。本系统可以适用于哺乳动物基因组的精确删除研究。
本研究的主要结果如下:
(1)构建了acNEHJ-USR筛选富集报告载体,该载体包括两个通用的sgRNA表达盒、一个被打断的并带有通用sgRNA靶位点的嘌呤霉素抗性基因和串联其后的一个绿色荧光蛋白表达盒。当报告载体与目的基因的sgRNA-Cas9表达载体共转染进细胞以后,载体中的两个通用sgRNA会导向Cas9蛋白对载体嘌呤霉素基因内的两个sgRNA识别位点进行切割,然后载体以acNHEJ方式进行修复以后,抗性基因被精确修复并启动表达,细胞表现出嘌呤霉素药物抗性。
(2)应用acNHEJ-USR富集系统对HEK293T细胞AAVS1、EMX1和CCR5基因位点进行精确删除编辑。通过对筛选后的细胞混合池基因组靶序列进行PCR及测序分析,acNHEJ-USR富集以后三个基因长片段删除效率分别为91.69%、90.63%和84.38%,比未筛选组效率分别提高了3.0倍、3.3倍和3.9倍。同时,acNHEJ-USR富集后的三个基因长片段精确删除的效率分别为82.29%、70.84%和63.55%,比未筛选组效率分别提高了6.6倍、6.2倍和7.6倍。
(3)应用acNHEJ-USR富集载体对猪PK15细胞中lnc-sscg3623进行精确删除编辑。在确定了lnc-sscg3623在猪的脂肪组织显著表达以后,利用acNHEJ-USR富集系统与靶向lnc-sscg3623基因组的双sgRNA打靶载体共转染猪PK15细胞,并对筛选后的细胞混合池基因组进行PCR和测序的鉴定分析。实现了猪PK15细胞lnc-sscg3623双等位基因的长片段精确删除,精确删除效率为10%,并获得双等位基因精确删除的细胞单克隆。
(4)对lnc-sscg3623精确删除的纯合细胞单克隆进行高通量测序分析。筛选出20个与脂肪代谢相关的表达量变化显著的候选基因,并通过qRT-PCR验证了测序结果的可靠性。然后过表达lnc-sscg3623以后,发现候选基因中只有ACAA2基因的表达变化与lnc-sscg3623的表达反向同步。结合对猪脂肪元代细胞核质分离和诱导分化后发现,lnc-sscg3623通过负向调控ACAA2基因的表达来抑制猪脂肪细胞的分化。对猪的lnc-sscg3623精确删除应用,证明了acNHEJ-USR系统可应用于非编码RNA的精确删除研究。
总之,acNHEJ-USR系统在对基因组的完整性不造成影响的前提下,可以简便高效的进行精确删除细胞的筛选富集。最后,该报告系统可以使双sgRNA介导的基于acNHEJ修复的基因长片段精确删除更广泛的应用于基因的功能研究及动物新品种的开发和基因删除模型动物的生产。
近年来的研究发现,有一种特殊的NHEJ修复方式,在Cas9核酸酶导致DNA的双链断裂修复时,游离的两端DNA不经过消化和修饰,而是由DNA连接酶直接将断裂切口连接。这种修复方式被称为精确NHEJ修复(Accurate-NHEJ,简称acNHEJ)。与经典的NHEJ通路不同,acNHEJ修复是精确和可预测的。研究人员发现acNHEJ几乎和经典的NHEJ一样高效。然而,acNHEJ介导的精确片段删除的报道长度仅在100bp以内,对于长片段的acNHEJ删除未见报道。
为了验证acNHEJ修复方式可以介导长片段精确删除,同时应用于CRISPR/Cas9介导的基因精确删除研究。本研究开发了一种可专门用于富集双sgRNA-Cas9介导的基于acNHEJ修复的精确删除阳性细胞的通用型报告载体系统(Accurate NHEJ-based Universal Surrogate Reporter, acNHEJ-USR)。该报告载体系统具有自我切割和自我修复的特点,将报告载体与靶向目的基因的双sgRNA打靶载体共转至细胞内,然后对细胞进行嘌呤霉素药物筛选5天以后,即可高效富集发生acNHEJ介导的精确删除细胞。本系统可以适用于哺乳动物基因组的精确删除研究。
本研究的主要结果如下:
(1)构建了acNEHJ-USR筛选富集报告载体,该载体包括两个通用的sgRNA表达盒、一个被打断的并带有通用sgRNA靶位点的嘌呤霉素抗性基因和串联其后的一个绿色荧光蛋白表达盒。当报告载体与目的基因的sgRNA-Cas9表达载体共转染进细胞以后,载体中的两个通用sgRNA会导向Cas9蛋白对载体嘌呤霉素基因内的两个sgRNA识别位点进行切割,然后载体以acNHEJ方式进行修复以后,抗性基因被精确修复并启动表达,细胞表现出嘌呤霉素药物抗性。
(2)应用acNHEJ-USR富集系统对HEK293T细胞AAVS1、EMX1和CCR5基因位点进行精确删除编辑。通过对筛选后的细胞混合池基因组靶序列进行PCR及测序分析,acNHEJ-USR富集以后三个基因长片段删除效率分别为91.69%、90.63%和84.38%,比未筛选组效率分别提高了3.0倍、3.3倍和3.9倍。同时,acNHEJ-USR富集后的三个基因长片段精确删除的效率分别为82.29%、70.84%和63.55%,比未筛选组效率分别提高了6.6倍、6.2倍和7.6倍。
(3)应用acNHEJ-USR富集载体对猪PK15细胞中lnc-sscg3623进行精确删除编辑。在确定了lnc-sscg3623在猪的脂肪组织显著表达以后,利用acNHEJ-USR富集系统与靶向lnc-sscg3623基因组的双sgRNA打靶载体共转染猪PK15细胞,并对筛选后的细胞混合池基因组进行PCR和测序的鉴定分析。实现了猪PK15细胞lnc-sscg3623双等位基因的长片段精确删除,精确删除效率为10%,并获得双等位基因精确删除的细胞单克隆。
(4)对lnc-sscg3623精确删除的纯合细胞单克隆进行高通量测序分析。筛选出20个与脂肪代谢相关的表达量变化显著的候选基因,并通过qRT-PCR验证了测序结果的可靠性。然后过表达lnc-sscg3623以后,发现候选基因中只有ACAA2基因的表达变化与lnc-sscg3623的表达反向同步。结合对猪脂肪元代细胞核质分离和诱导分化后发现,lnc-sscg3623通过负向调控ACAA2基因的表达来抑制猪脂肪细胞的分化。对猪的lnc-sscg3623精确删除应用,证明了acNHEJ-USR系统可应用于非编码RNA的精确删除研究。
总之,acNHEJ-USR系统在对基因组的完整性不造成影响的前提下,可以简便高效的进行精确删除细胞的筛选富集。最后,该报告系统可以使双sgRNA介导的基于acNHEJ修复的基因长片段精确删除更广泛的应用于基因的功能研究及动物新品种的开发和基因删除模型动物的生产。