牙周病是牙齿支持组织，包括牙周膜、牙槽骨、牙骨质在内的炎症性疾病，若未得到及时治疗可导致牙槽骨的吸收致使牙齿脱落，它是严重危害人类牙齿和全身健康的常见口腔疾病。牙周病学的研究已成为口腔界的主要研究领域，并在此领域的研究中取得了长足的进步。但由于目前常规牙周治疗方法的局限性，尚不能再生出完整的牙周组织，而组织再生技术弥补了牙周组织再生过程中的某些不足，已开始应用于牙周再生领域。移植干细胞对组织的修复和重建能力取决于种子细胞自身的生物学特性以及宿主微环境的直接和间接的作用。目前对于组织工程中干细胞和微环境谁的主导作用更为明显尚存在争议。但总体概念是干细胞和微环境相互影响，共同介导了种子细胞的迁移、定植、分化和增殖过程。宿主植床内时空分布的各种信号分子介导了干细胞的分化和增殖；同时种子细胞通过旁分泌作用改善宿主微环境，甚至调控机体全身状况达到组织再生和修复的目的。因此，选择合适的种子细胞类型不仅关系到种子细胞本身的生物学活性，也影响着宿主微环境；而改善宿主微环境则更利于移植干细胞的存活、分化和活性的发挥。牙周膜干细胞（PDLSC）和骨髓基质干细胞(BMMSC)是具有多向分化潜能的间充质干细胞，但其再生能力受移植模式、诱导环境、宿主微环境调控等条件的影响。两种干细胞的所表现出的牙周再生能力尚不一致，近年来两种不同的干细胞在基础研究领域及临床组织器官修复领域广泛应用。因而，能否利用两种干细胞不同分化的特性在牙周组织工程中协同作用，再生出牙槽骨、牙周膜/牙骨质样组织，为应用干细胞治疗的内源性再生医学技术作为转化为临床治疗手段提供依据。为此本课题设计为以下三个部分：第一部分骨髓基质干细胞与人牙周膜干细胞膜片的制备与鉴定目的：通过有限稀释法成功分离培养人牙周膜干细胞与骨髓基质干细胞，并制备成单层细胞膜片与牙本质片和HA-TCP共培养，检测干细胞和细胞膜片的生物学活性。方法：通过流式细胞仪检测牙周膜干细胞与骨髓基质干细胞的细胞表型和细胞周期；对两种干细胞进行成骨和成脂诱导；MTT和克隆形成率检测评价其增殖能力；组织学和免疫组织化学观察单层细胞膜片的结构；将两种膜片与牙本质片和HA-TCP共培养电镜观察支架材料对膜片结构的影响。结果：1、两种干细胞具有集落化生长的趋势；2、两种干细胞成骨成脂诱导后茜素红染色和油红O染色阳性；3、制备的单层hPDLSC膜片和BMMSC膜片内大量细胞外基质沉积、细胞排列更为紧密、极性化更为明显，均强阳性表达Col-I，OCN、Lamin等细胞外基质的结构蛋白，弱表达Col-Ⅲ；4、膜片与支架材料共培养电镜结果显示膜片内细胞形态未见显著性变化，细胞复层化趋势更为明显，层间细胞间有序地连接，细胞的极性化趋势更为明显，BMMSC组可见空间分布更为广泛和致密的细胞外矿化基质的沉积。结论：本组分离培养的PDLSC和BMMSC具有间充质干细胞特性。以其为种子细胞的膜片具有丰富的细胞外基质，能够介导细胞与支架材料的吸附和定植。第二部分两种干细胞膜片复合不同支架材料体内异位再生的实验研究目的：通过将hPDLSC膜片与hBMMSC膜片复合后与牙本质片和HA-TCP共培养，并进行体内不同部位移植以评价体内及体外微环境对干细胞分化的影响。方法：通过两类单层膜片复合后与牙本质片和HA-TCP共培养，电镜和组织学动态观察膜片显微结构变化，并将hPDLSC cs、hBMMSC cs和hPDLSC/BMMSC cs进行皮下和颅骨缺损移植比较组织再生情况。结果：1、双层细胞膜片的质地更为致密，细胞结合紧密，表面大量矿化沉积，细胞与牙本质的骨架结合紧密；2、三种膜片无支架材料皮下移植均仅有质地、走形不一致的纤维组织的再生，未见矿化物质的生成；3、三种膜片复合牙本质片皮下移植均可形成不均量的矿化物沉积和纤维样组织，似牙周膜/牙骨质样结构，PDLSC组和PDLSC/BMMSC组再生的纤维穿通性更明显，表面矿化沉积更均衡；4、三种膜片复合HA-TCP皮下也形成类牙周膜/牙骨质样结构，但纤维和矿化物的沉积均差于相应的牙本质片组，以BMMSC组最差；5、颅骨缺损修复组织学结果显示植入区无明显炎症反应，炎细胞较少，缺损边缘可见大量的新生骨组织形成。结论： hPDLSC/BMMSC复合膜片能够整合两种干细胞的生物学特性，在适宜的微环境作用下更有利于干细胞向牙周再生方向定向分化。第三部分犬PDLSC/BMMSC膜片在牙周组织缺损修复再生中的实验研究目的：观察犬PDLSC cs、BMMSC cs和PDLSC/BMMSC cs对犬急性牙周缺损的再生作用。方法：分离培养犬PDLSC和BMMSC，并制备PDLSC cs、BMMSC cs和PDLSC/BMMSC cs；建立急性牙周缺损模型，进行膜片移植，组织学及影像学评价。结果：1、PDLSC和BMMSC两种干细胞都具有间充质干细胞特性；2、犬PDLSC cs和BMMSC cs的成膜速度均快于人的两种干细胞膜片；3、对PDLSC膜片、BMMSC膜片和PDLSC/BMMSC复层膜片术前术后的影像学结果比较显示：三组均有较强的骨组织再生修复能力，牙槽骨缺损均达到完全修复，术前术后牙槽骨密度、邻间牙槽嵴高度、附着丧失未见显著差异。对照组骨密度有一定程度增加，牙槽骨增加不明显。4、组织学观察显示：PDLSCs，BMMSCs及PDLSCs/BMMSCs组牙周缺损部分均有不同程度的修复和再生，而空白对照组增生不明显。结论：PDLSC cs、BMMSC cs对牙周组织再生均起着重要的作用。PDLSC/BMMSC cs能够利用两种干细胞分化特性，在牙槽骨、牙根面等复杂的牙周微环境作用下再生出牙槽骨、牙周膜/牙骨质样组织。