过表达与干扰LXRβ基因对奶山羊乳腺上皮细胞脂质代谢的影响

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:skynan2001
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肝脏X受体β(Liver X receptorβ,LXRβ)是核受体LXRs基因的亚型之一,是参与调控机体脂质代谢的关键转录因子,它通过与视黄醛X受体共价结合,组成异二聚物后靶定至基因的调控区域,如固醇调节元件结合蛋白-1和脂肪酸合酶的启动子上,影响其转录,进而影响到机体脂质的代谢。本研究通过克隆得到奶山羊LXRβ基因的编码区,将其重组至腺病毒载体中,进一步转染重组质粒进入293A细胞,获取高滴度的腺病毒,同时在线设计并合成siLXRβ,在奶山羊乳腺上皮细胞中分别超表达和干扰LXRβ基因后,通过RT-qPCR和Western Blot等方法检测细胞内脂代谢基因表达量及胞内脂质含量的变化,为进一步明确该基因在乳脂代谢调控中的功能奠定理论基础。以下为本研究获得的主要研究结果:(1)通过提取西农萨能奶山羊乳腺组织总RNA,根据GenBank中收录的羊(XM018062857)的LXRβ基因序列设计引物,利用RT-PCR技术克隆得到山羊LXRβ基因CDS序列,其长度为1 368 bp,编码455个氨基酸。山羊LXRβ基因CDS区序列与牛(Bos taurus)、绵羊(Ovisaries)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的相似性分别为98%、98%、87%和85%,氨基酸序列相似性分别为99%、99%、90%和91%。(2)成功获得含有目的基因的重组质粒pAdEasy-LXRβ,转染293A细胞后得到高滴度腺病毒,滴度为109 U/mL。通过在山羊乳腺上皮细胞中添加不同体积的病毒液,确定其最佳感染复数(MOI)为200。病毒处理细胞48h后,RT-qPCR结果显示LXRβ基因表达量上升100倍左右,被T0901317激活后,SREBP-1、FASN、SCD、ACSL1、ACSL3、ACCα及ELVOL6基因均显著上调(P<0.05),FADS1基因的表达水平无明显变化;Western blot结果表明FASN蛋白表达量显著增加;油红O和甘油三脂检测结果说明LXRβ基因可以显著上调细胞内的脂滴数量和胞内甘油三酯的含量;脂肪酸组分分析表明细胞中C18:1的含量显著上升(P<0.05)。(3)根据LXRβ基因CDS序列,设计特异针对其的siRNA并转染山羊乳腺上皮细胞,RT-qPCR结果表明LXRβ基因表达量显著下调了88%,干扰LXRβ表达后,不添加激动剂时DGAT2基因下调30%,SREBP1基因上调50%,其他脂代谢基因变化不显著,添加激动剂之后相对于对照组SREBP1和FSAN基因分别下调15%和35%,ASCL1基因表达量上调30%左右,ACSL3、FADS1、ELOVL6以及SCD基因表达量变化不显著;甘油三脂检测结果表明当LXRβ表达量下降时,胞内甘油三脂含量随之减少。综上所述,本试验成功克隆得到了奶山羊LXRβ基因的CDS区,构建了超表达载体,通过感染山羊乳腺上皮细胞超表达LXRβ基因并添加激动剂可导致众多脂代谢基因的mRNA表达水平显著上调,胞内脂滴含量增加,干扰该基因的表达对脂代谢基因的mRNA表达以及胞内甘油三酯合成有一定的抑制作用。为明确LXRβ基因在奶山羊乳腺细胞中乳脂代谢中的功能提供理论依据。
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