论文部分内容阅读
脑卒中因高发病率、高致残率和高致死率给家庭和社会带来沉重的负担。目前脑卒中治疗药物主要有以rt-PA为代表的溶栓、抗凝药以及抗血小板聚集等化学药物。由于脑缺血再灌注损伤过程涉及多细胞组分,有多种因素参与病程,上述药物往往只针对单一环节进行干预,因而效果有限。中医药是中华文明的瑰宝,是在劳动人民长期实践活动中总结发展而成,强调全身论治,作为一种“整合医学”在复杂疾病治疗方面优势明显。安脑片是安宫牛黄改方中药,在保证药效的同时降低了安宫牛黄的毒性和成本。尽管安脑片在临床上疗效显著,但具体作用机制仍有待进一步研究。本研究基于大鼠大脑中动脉梗阻(MCAO)2 h后复灌诱导缺血再灌注损伤模型,观察安脑片给药治疗对模型大鼠的保护作用,进而讨论安脑片的深入机制,为安脑片的临床应用提供理论支撑。第一部分安脑片抗脑缺血再灌注损伤药效学研究1.建立大鼠缺血再灌注损伤模型,口服给药1 d、7 d后评价治疗效应。实验数据显示,模型组大鼠的大鼠神经功能缺损症状评分显著增加(P<0.001),安脑片可显著降低大鼠神经功能缺损症状评分(P<0.001);2.TTC染色结果显示,大鼠脑缺血再灌注急性期的脑梗死体积显著增加(P<0.001);而安脑片治疗能够显著降低急性期大鼠脑梗死体积(P<0.001);3.进一步采用H&E染色分析,在脑缺血再灌注急性期,模型组大鼠脑梗死体积明显升高(P<0.01),安脑片各治疗剂量组则可以显著降低急性期脑梗死体积(P<0.05);4.分析脑缺血再灌注急性期及长期损伤组大鼠的脑损伤侧半暗带及梗死灶组织的NeuN功能性神经元数目。数据结果表明,模型组大鼠神经元丢失明显(P<0.001),而安脑片各治疗剂量组则明显减少了脑缺血再灌注大鼠大脑损伤侧半暗带、梗死灶区域神经元的丢失(P<0.001)。第二部分 安脑片抗脑缺血再灌注损伤作用机制研究1.首先分析了模型大鼠急性期损伤侧梗死灶脑组织中的线粒体动力学相关蛋白水平。实验数据证明,脑缺血再灌注急性期损伤(1 d)会显著增加线粒体融合、分裂蛋白OPA1、Drp1的表达(P<0.05,P<0.05),而安脑片急性期干预治疗组可显著降低上述2个蛋白的表达水平,从而缓解线粒体融合分裂急性应激的影响;2.通过进一步分析急性期大鼠大脑损伤半球半暗带中的线粒体动力学相关蛋白表达水平,可发现脑缺血再灌注急性期损伤(1d)能够显著降低线粒体融合、分裂蛋白OPA1、Drp1的表达(P<0.05),安脑片急性期干预治疗组则能够明显促进OPA1和Drp1的表达,从而发挥其改善线粒体动力学障碍的作用;3.同时,通过观察脑缺血再灌注长期损伤大鼠大脑的损伤半球梗死灶和半暗带区域中的线粒体动力学相关蛋白表达水平,可发现,脑缺血再灌注长期损伤(7d)大鼠的上述组织中线粒体融合、分裂蛋白OPA1、Drp1的表达水平显著下降(P<0.05,P<0.05),安脑片长期干预治疗组能够明显提高OPA1和Drp1的表达,进而发挥其改善线粒体动力学障碍的作用;4.大鼠大脑损伤半球的半暗带、梗死灶区域中的线粒体自噬相关蛋白表达数据结果显示,脑缺血再灌注急性期和长期损伤(1 d和7d)会显著降低PINK1/Parkin的表达(P<0.05),安脑片急性期干预治疗组和长期干预治疗组均能显著升高上述两个蛋白的表达水平,从而促进神经元内线粒体自噬过程。5.此外,缺血再灌损伤显著降低Bcl-2/Bax的比例(P<0.05),安脑片急性期干预治疗组和长期干预治疗组可明显提高大鼠损伤侧半暗带和梗死灶组织的Bcl-2/Bax的比例(P<0.05,P<0.001),抑制细胞凋亡。第三部分安脑片对神经微环境胶质细胞及其表型转化的影响1.对大鼠损伤侧半暗带、梗死灶区域星形胶质细胞、小胶质细胞数量进行分析。结果显示,在脑缺血急性期,半暗带组织中,星形胶质细胞、小胶质细胞数量显著增加(P<0.001);梗死灶组织中,星形胶质细胞数量减少(P<0.001)、小胶质细胞数量显著增加(P<0.001),而安脑片干预1天组大鼠皮层的小胶质细胞的数量明显增多;在脑缺血长期损伤中,半暗带组织中,星形胶质细胞、小胶质细胞数量显著增加(P<0.001);梗死灶组织中,星形胶质细胞数量减少(P<0.01)、小胶质细胞数量显著增加(P<0.001);而安脑片干预7天组对星形胶质细胞和小胶质细胞的数量无明显影响;2.进一步对大鼠损伤侧半暗带区域星形胶质细胞活化分型进行分析。结果显示,脑缺血再灌注损伤1d和7d后A1型星形胶质细胞数量显著增加(P<0.05,P<0.001)、A2型星形胶质细胞数量显著减少(P<0.05);而安脑片1d干预治疗组和7d干预治疗组可显著降低A1型星形胶质细胞的数量(P<0.05,P<0.01),同时显著增加A2型星形胶质细胞的数量(P<0.01,P<0.05);3.对大鼠损伤侧半暗带小胶质细胞活化分型进行分析。结果显示,脑缺血再灌注损伤1 d和7d后M1型小胶质细胞数量显著增加(P<0.05)、M2型星形胶质细胞数量显著减少(P<0.05);而安脑片1d干预治疗组和7d干预治疗组可显著降低M1型星形胶质细胞的数量(P<0.01,P<0.001),同时显著增加M2型星形胶质细胞的数量(P<0.01,P<0.05)。4.为了进一步研究神经元与星形胶质细胞的相互作用,在大鼠原代培养皮层神经元、星形胶质细胞上建立OGD/R模型,采用造模后不同时间点A2型星形胶质细胞条件培养基与神经元共培养24 h,对正常与损伤神经元的IOD值检测结果显示,星形胶质细胞条件培养基能够显著增加神经元活性,并且72 h的条件培养基的神经保护作用达到最高。5.采用造模后不同时间点神经元条件培养基与星形胶质细胞共培养24 h,对正常与损伤星形胶质细胞的存活率检测结果显示,神经元条件培养基对星形胶质细胞无明显影响。综上,我们研究发现安脑片短期给药和持续给药对脑缺血再灌注模型大鼠脑组织均呈现良好的神经保护作用,可显著改善缺血再灌所致的线粒体功能障碍,抑制神经元的凋亡。安脑片能够通过对缺血损伤后星形胶质细胞与小胶质细胞活化分型的改变,有效维持脑内稳态,改善受损后的脑功能。本研究为安脑片抗脑缺血再灌注损伤的临床应用提供了实验和理论支持。