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稻瘟病是水稻的重要病害之一,对全球水稻生产造成极大危害。从天然产物中寻找新的抗稻瘟病及抗其它病虫害的农药或先导化合物,已成为当今农药开发的主题。云南省被国际生物多样性保护组织列为全球25个生物多样性热点地区之一,气候多样,地形复杂,有着丰富的微生物资源,放线菌资源尤为丰富。充分利用云南省丰富的放线菌资源,开发新颖的、与环境相容性高的抗稻瘟病农药,具有强烈的现实意义和深远的科学意义。
本论文对三种活性复筛模型复筛到的二株放线菌YIM39205、YIM30997,进行了抗稻瘟病的活性成分研究。并提出基于TLC的去重复方法,以提高发现新化合物的效率。另外提出TLC化合物多样性指标公式及衡量培养基“好坏”的模糊指标,以便在新药研发前期更好的对培养基进行优化。具体结果如下:
1、从初筛的334株抗稻瘟病放线菌中,复筛活体活性大于70%的49株菌,得到抑制孢子萌发、抑制菌丝生长和盆栽防效高且稳定的二株放线菌YIM39205、YIM30997。初步分类鉴定发现:YIM39205与公牛链霉菌(Streptomyces tauricus)16s RNA基因亲缘关系最近,相似性约为98.9%,但有些指标有所不同;YIM30997被鉴定为链霉菌的一个新种:绿蓝链霉菌(Streptomyces viridocyaneus)。确定对YIM39205、YIM30997为抗稻瘟病活性成分研究的菌株。
2、用1#、61#以及301#培养基对菌株YIM39205、YIM30997进行培养基筛选,确定对YIM39205采用1#培养基,对YIM30997采用301#培养基进行放大发酵。
3、YIM39205放大发酵产生多个活性成分。通过各种柱层析手段,结合活性跟踪,共分离纯化得到7个化合物,其中39205-1P、39205-2P、39205-3P、39205-5P具有抗稻瘟病活性。39205-2P结构被鉴定为苯安莎环类抗生素除锈霉素A(Herbimycin A),39205-3P结构被鉴定为聚醚类抗生素尼日利亚霉素(Nigericin)。另外,39205-1P和39205-5P无适当溶剂溶解;39205-6P被鉴定为Leu-Tyr环肽;39205-7P被鉴定为黄酮苷类化合物;39205-4P结构还在进一步解析中。
4、采用同样的方法,从菌株YIM30997的代谢产物中分离纯化得到6个化合物,其中390997-1P具有抗稻瘟病活性,被鉴定为大环内酯类抗生素杀黑星菌素A(VenturicidinA)。另外,390997-2P,390997-3P被鉴定为黄酮类化合物;30997-4P被鉴定为胸腺嘧啶;30997-5P被鉴定为Ala-Leu环肽;392056P被鉴定为黄酮苷类化合物。
5、提出基于TLC去重复数学模型,将TLC定性鉴定定量化,用最小最大法,在不需要随行已知化合物对照(或仅随行通用对照)情况下,对样品含已知化合物的概率进行定量计算,计算结果小于0.05的已知化合物可以排除,如果均小于-0.05,则很可能存在不同于已知化合物的新化合物。同时给出计算样品含已知化合物概率的Matlab程序:TLCdereplication version0.2.m
6、提出化学多样性定量公式,将化学多样性和活性综合成培养基“好”的模糊指标,以便在新药研发前期,在不知道活性成分或活性成分不容易定量时对培养基进行优化。结果表明:取对数多样性指标比条带多样性反应灵敏;“多样性好”和“活体防效好”有一定相关性;模糊指标反映了综合信息,在新药研发前期可以用来进行培养基优化。
主要创新点:
1、首次报道从公牛链霉菌(Streptomyces tauricus YIM 39205)中分离获得除莠霉素A(Herbimycin A),尼日利亚霉素(Nigericin);首次从绿蓝链霉菌(Streptomyces viridocyaneus YIM 30997)中分离杀黑星菌素A(Venturicidin A),扩大了活性化合物菌种资源。
2、提出化学多样性定量公式,并将它和其它遗传多样性分子指标联系起来,丰富了遗传多样性分子标记的内容。
3、提出反映“化学多样性好”和“活性好”的模糊指标并用于新药研发前期培养基优化,克服了:1)不知道活性成分或活性成分不容易定量时培养基优化,2)活性作为优化指标时,很多相同(如孢子萌发抑制率很多为0)数据,获取信息量少(统计学上,大部分数据相同表示信息少),3)指标仅含有活性信息。
4、建立基于TLC去重复数学模型,将TLC定性鉴定定量化,可以在不需要随行对照或仅随行通用对照就能对样品所含化合物进行概率化的定性鉴定。