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目的:糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)及糖尿病肾脏病变(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病重要的微血管病变,是糖尿病患者致盲及肾衰的重要原因。色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor,PEDF)分子量为50kb,含418个氨基酸,是一种多功能的丝氨酸蛋白酶抑制剂。近年来研究显示,在糖尿病微血管并发症大鼠模型眼部及肾脏局部组织中,其表达量有所下降,而在糖尿病微血管并发症患者血清水平则有所升高。在视网膜,晚期糖基化终末产物(advanced glucose ends,AGEs)诱导超氧化物的产生和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的激活,而PEDF通过抑制AGEs阻止视网膜炎症的发生。在肾脏组织,PEDF可以抑制转化生长因子β-1(transforming growth factorβ-1,TGFβ-1)和结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor,CTGF)的表达,显著降低细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的产生。PEDF通过抑制炎症以及氧化应激反应、促进内皮细胞凋亡、抑制纤维化作用起到延缓糖尿病微血管病变发生、发展的作用。单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)是在基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性,是人类可遗传变异中最常见的一种。PEDF编码基因位于染色体17p13.1,基因长约16kb,其启动子区SNP位点可能通过影响基因转录活性而改变蛋白的表达。本研究分析271例河北地区汉族人PEDF启动子区2个SNP位点与2型糖尿病微血管病变的关系,探讨PEDF在糖尿病微血管病变发生、发展中的作用及作用机制。方法:选取我院271例住院的2型糖尿病(type2 diabetes mellitus,T2DM)患者,均为河北地区汉族人,根据有无糖尿病微血管并发症分成两组:无糖尿病微血管病变组(对照组)105例,合并糖尿病微血管并发症组(病变组)166例。依据病史、临床症状及相关化验检查排除大血管病变。所有研究对象均测量身高及体重,计算体重指数(body mass index,BMI)。同时测定空腹甘油三酯(triglyeride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C),高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C),空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)以及糖化血红蛋白(HbA1c)、尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate,UAER)等生化指标。采用放射免疫分析法测定空腹血清胰岛素(fasting insulin,FINS)水平,并应用稳态模式评估法(homeostasis model assessment,HOMA)计算胰岛素抵抗指数。同时随机抽取对照组患者30例,病变组患者33例,应用ELISA试剂盒检测血清PEDF水平。采用微量快速DNA提取法提取外周血白细胞DNA,聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法检测PEDF基因启动子区rs12150053及rs12948385的基因型和等位基因频率分布情况。数据统计分析采用SPSS13.0版软件包进行,P<0.05认为有统计学意义。两组计量资料行t检验,计数资料用χ2检验。以Logistic回归法计算相对风险度的比值比(odds ratio,OR)及95%可信区间(confidence Interval,CI)。采用2LD软件分析rs12150053 T/C与rs12948385 G/A基因连锁不平衡,EH软件分析基因单体型频率。结果:1两组性别构成比无显著性差异,与对照组相比,病变组的年龄及病程显著增高(P<0.01),TG、LDL-C、BMI及HbA1c亦高于对照组。病变组与对照组比较FBG、TC、HDL-C、HOMA-IR均无显著性差异。2病变组血清PEDF水平为:269.2±138.6 pg/ml,对照组血清PEDF水平为:199.6±85.4 pg/ml,两组比较具有显著性差异(P=0.02)。3对照组rs12150053 C/T和rs12150053 G/A多态位点的基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。PEDF启动子区rs12150053 -790C/T多态T/T、C/T、C/C基因型频率在对照组和病变组分别为79.0%、20.0%、1.0%和67.5%、30.7%、1.8%,两组相比无显著性差异(P=0.099)。C、T等位基因频率在对照组和病变组分别为87.1%、12.9%和82.8%、17.2%,两组相比具有显著性差异(χ2=3.951,P=0.047)。与T/T基因型相比,C/T+C/C基因型增加糖尿病微血管病变的发病风险,OR值为1.8(295%CI=1.027~3.221)。4 PEDF启动子区rs12948385 -358G/A多态G/G、G/A、A/A基因型频率在对照组和病变组分别为75.2%、21.9%、2.9%和59.0%、36.7%、4.3%,两组相比具有显著性差异(P=0.024)。G、A等位基因频率在对照组和病变组分别为86.2%、13.8%和77.4%、22.6%,两组相比具有显著性差异(P=0.025)。与G/G基因型相比,G/A+A/A基因型增加糖尿病微血管病变的发病风险, OR值为2.108(95%CI=1.228~3.619)。5 rs12150053 T/C和rs12948385 G/A SNP间存在连锁不平衡关系(D′=0.68)。应用EH软件对2个SNPs位点分析发现,T/G单体型在对照组最常见,占77.4%。包含rs12150053 T与rs12948385 A的单倍体型在病变组显著性增高,可能会增加糖尿病微血管病患病风险,OR值为1.767(95%CI=1.061~2.944)。结论:1应用碘化钾快速DNA提取法提取外周血DNA简便、快速、经济,所得DNA纯度及浓度较高,可应用于DNA基因组研究。2糖尿病微血管病变可能与病程相关,糖化血红蛋白、体重指数、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇可能是糖尿病微血管病变的危险因素。3糖尿病合并微血管病变患者血清PEDF水平显著增高,PEDF血清学变化可能是糖尿病微血管病变的预测因子。4 PEDF基因启动子区rs12150053 -358G/A和rs12948385 -790C/T单核苷酸多态性与糖尿病微血管病变发病相关,-790C/T的C/T+C/C基因型和-358G/A的G/A+A/A基因型增加糖尿病微血管病变的发病风险。