阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)即老年性痴呆症,是一种发生于中枢神经系统的慢性、原发性、渐进性、不可逆性的退行性变,常表现为认知功能障碍、精神行为异常和生活能力下降。AD的典型病理特征为脑内出现以淀粉样p蛋白(myloid β protein, Aβ)为核心的老年斑、磷酸化tau蛋白(Phosphorylated tau protein, P-tau)为主要成分的神经原纤维缠结及神经元的丢失。目前,关于AD的发病机制存在众多假说,诸如Aβ级联假说、tau蛋白假说、氧化应激假说、神经炎性假说、钙平衡自体失衡假说、胆碱能假说及兴奋毒假说等,其中Ap级联假说被广泛认可。Aβ作为老年斑的核心成分,已被证明具有较强的神经毒性,其在AD患者脑内(尤其是海马内)沉积而引起细胞钙超载、胆碱能系统损害、突触数目减少及神经元变性死亡是AD患者出现认知功能障碍的主要病因。神经甾体(neurosteroid)是神经系统中(主要是脑内)以胆固醇为底物,经相关酶催化合成的甾体类物质。神经甾体主要包括脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone, DHEA)及其硫酸酯(Dehydroepiandrosterone sulfate, DHEAS)、孕烯醇酮及其硫酸酯、孕酮及别孕烯醇酮等。神经甾体在脑、血浆及肾上腺中的水平往往随年龄增高而减低,与此同时常伴发年龄相关的神经功能障碍及神经退行性变,诸如AD、帕金森病、C型尼曼—匹克病等。这提示神经甾体作为内源性神经保护因子能够使神经元免受有毒物质的损伤。近年研究发现,神经甾体尤其是DHEAS与AD等神经退行性疾病存在密切相关性。AD患者下丘脑常出现DHEAS的减低伴P-tau的增多,纹状体和小脑中出现DHEAS减低伴Ap的增多。DHEAS与这些构成神经原纤维缠结和老年斑的关键蛋白的相关性提示,脑内DHEAS在AD的病理进程中具有极其重要的作用,其水平的减低可能与AD发病有关。另外,研究还证明,DHEAS能够拮抗NMDA介导的兴奋毒性、促进乙酰胆碱(ACh)的释放并有效地抑制由Ap引起的钙超载。一般情况下,DHEA及DHEAS在脑内含量随年龄增高而逐渐减低,但AD患者脑内特别是海马及颞叶皮层中DHEA水平显著增高,而同时DHEAS水平则出现下降。据此推测,AD患者脑内的DHEA与DHEAS的转化存在异常。鉴于DHEAS可被甾体硫酸酯酶作用脱去硫酸基团转化为单体形式的DHEA,我们提出假设：通过使用硫酸酯酶抑制剂DU-14抑制硫酸酯酶的活性可以提高脑内DHEAS水平,有可能拮抗Aβ引起的神经毒性伤害,改善学习记忆功能、神经元网络电活动及突触可塑性。本研究通过双侧海马注射Aβ1-42建立AD的动物模型,借助Morris水迷宫试验、在体海马局部场电位(local field potential, LFP)和在体海马突触长时程增强(long term potentiation, LTP)记录等实验手段,通过析因设计观察DU-14是否能够拮抗由Aβ1-42引起的大鼠空间学习记忆、神经网络电活动以及突触可塑性的损害,旨在探讨DHEAS的神经保护作用并为AD预防治疗药物的研发提供新的思路。研究主要包括以下内容：(1)利用Morris水迷宫试验观察海马注射Ap1-42是否可以导致大鼠空间学习记忆能力的损伤,DU-14是否能够有效拮抗由Aβ1-42导致的这一损伤；(2)行为学实验结束后,观察同一批实验动物海马神经网络振荡活动,探讨DU-14是否能够拮抗Aβ1-42造成Theta节律异常；(3)利用在体海马突触长时程增强记录技术,观察Aβ1-42对海马突触可塑性的影响,并探讨DU-14是否能够拮抗Aβ1-42引起的长时程增强的压抑。第一部分DU-14拮抗Ap1-42导致的大鼠空间学习记忆损伤目的：探讨Aβ1-42引起的大鼠空间学习记忆能力损伤能否被DU-14预处理所拮抗。方法：选取运动功能正常、无视力障碍的健康成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(180g～220g),随机分成四组:vehicle+saline组,DU-14+saline组,vehicle+Aβ组及DU-14+Aβ组。将大鼠麻醉后,在三维脑立体定位仪引导下,将药物用微量注射泵缓慢注射到双侧海马CAl区。缝合手术创口,待其清醒并恢复两周后,进行Morris水迷宫试验。本试验由三部分组成：定位航行试验,用以评估空间学习能力；空间探索试验,用以评估空间记忆能力；可视平台试验,用以排除大鼠的运动和视力障碍。主要观察指标为各组大鼠的逃避潜伏期、在目标象限游泳时间百分比及平均游泳速度。结果：(1)定位航行试验显示,在第1～5天中随着训练天数的推移,各组大鼠找到水下平台的潜伏期明显缩短,反映了大鼠的空间学习过程。在第2～5训练日的同一天内,vehicle+Aβ组大鼠找到水下平台的潜伏期明显长于vehicle+saline组(P<0.001);而DU-14+Aβ组大鼠的逃避潜伏期明显低于vehicle+Aβ组(P<0.001)。(2)空间探索试验显示,在撤除水下平台后,vehicle+Aβ组大鼠在目标象限(原平台所在象限)的游泳时间百分比明显小于vehicle+saline组(P<0.001)；而DU-14+Aβ组大鼠在目标象限游泳时间的百分比明显较vehicle+Aβ组高(P<0.001)。(3)可视平台实验显示,各处理组间大鼠平均游泳速度及到达可视平台的潜伏期均没有明显差异(P>0.05)。结论：双侧海马注射Aβl-42可严重损伤大鼠的空间学习及记忆能力,而DU-14预处理可以有效拮抗Aβ1-42所致大鼠空间学习记忆能力的损害。该部分实验结果初步提示,神经甾体硫酸酯酶抑制剂DU-14具有神经保护作用,可能在改善AD患者认知功能中发挥有益作用。第二部分DU-14拮抗Aβ1-42对大鼠海马theta节律的抑制目的：观察Aβ1-42对海马神经网络振荡活动的影响,探讨DU-14预处理是否可拮抗Aβ1-42对大鼠海马CAl区theta节律的抑制作用。方法：Morris水迷宫试验后的次日,经乌拉坦适度麻醉后,分别对四组大鼠进行在体海马局部场电位theta节律的诱导和记录。结果：(1)双侧海马注射DU-14及Aβ1-42对海马CAl区theta节律功率峰对应的频率值无明显影响。夹尾刺激后,vehicle+saline组,vehicle+Aβ组,DU-14+saline组及DU-14+Aβ组四组大鼠诱导出theta节律功率峰对应的频率值分别是3.26±0.05Hz,3.19±0.04Hz,3.21±0.07Hz,3.10±0.05Hz,无统计学差异(P>0.05)。(2)双侧海马注射Aβ1-42可明显压抑海马CAl区theta节律功率峰值,单独注射DU-14对海马CAl区theta节律功率峰值无影响,但DU-14可有效拮抗Aβ1-42对大鼠海马CAl区theta节律功率的抑制作用。对夹尾后诱导的theta节律进行功率谱分析,发现vehicle+Aβ组大鼠海马CAl区theta节律的功率峰值为22.29±0.78dB,明显低于vehicle+saline组的28.78±1.10dB(P<0.001)；而DU-14+Aβ组功率峰值为25.61±0.90dB,明显高于vehicle+Aβ组(P<0.01)。结论：双侧海马注射DU-14和Aβ1-42对由夹尾诱导的theta节律功率峰对应的频率值没有明显的影响, Aβ1-42可显著压抑海马theta节律的功率峰值,而DU-14能够有效拮抗Aβ1-42对海马theta节律功率的抑制作用。初步提示,DU-14可通过拮抗Aβ1-42的神经毒性,缓解Aβ1-42对神经网络振荡活动的损害。第三部分DU-14拮抗Aβ1-42引起的大鼠海马LTP压抑目的：观察DU-14及Aβ1-42对大鼠海马CAl区突触可塑性长时程增强的影响,从突触可塑性角度探讨DU-14拮抗Aβ1-42神经毒性的电生理学机制。方法：完成在体海马局部场电位记录之后,在脑立体定位仪的精确引导下,将自制的平行绑定电极(同心圆双极刺激电极与单极记录电极进行绑定)插入到背侧海马,通过刺激海马schaffer侧支,在CAl区放射层记录场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)。选择I/O曲线上50～65%最大fEPSP对应的刺激强度的单个脉冲刺激来诱发和记录基础fEPSP；至少稳定记录基础fEPSP30分钟后,通过双脉冲刺激诱发、记录双脉冲易化(paired pulse facilitation,PPF);最后通过三组高频刺激(high frequency stimulation,HFS)诱导LTP,刺激强度为I/O曲线上75～85%最大fEPSP对应的刺激强度；在HFS刺激后恢复单脉冲刺激,刺激强度同诱发基础fEPSP的刺激强度,至少记录60分钟。结果：(1)双侧海马注射DU-14及Ap1-42对海马CAl区PPF无明显影响,在给予双脉冲刺激之后,vehicle+saline组、vehicle+Aβ组、DU-14+saline组及DU-14+Aβ组四组大鼠的fEPSP2/fEPSPl的值分别为165.5±5.9%、160.6±5.5%、158.3±5.8%、169.7±6.9%,各组之间无显著统计学差异(P>0.05)。(2)海马注射Aβ1-42显著抑制了HFS诱导的在体海马CAl区的LTP,高频刺激后即刻,vehicle+Aβ组LTP诱导值为135.2±2.9%,明显低于vehicle+saline组的187.3±7.1%(P<0.001)；同时海马注射Aβ1-42也显著抑制了LTP的维持,高频刺激60分钟后,vehicle+Aβ组LTP维持在128.2±3.1%,明显低于vehicle+saline组的146.0±3.9%(P<0.01)。(3)海马单独注射DU-14对LTP没有明显影响,但DU-14可以显著拮抗Ap1-42对LTP的压抑作用。高频刺激后即刻,DU-14+Aβ组的LTP值为173.4±4.8%,明显高于vehicle+Aβ组的135.2±2.9%(P<0.001)；在高频刺激后60分钟时,DU-14+Aβ组的LTP维持在143.9±4.2%,明显高于vehicle+Aβ组的128.2±3.1%(P<0.01)。结论：海马注射Aβ1-42可以明显压抑在体海马CAl区LTP的诱导和维持,而对PPF无影响,说明其对LTP的压抑主要是通过突触后机制而非影响突触前的递质释放。DU-14处理可以有效拮抗Aβ1-42对LTP的压抑效应,提示在突触层面上,DU-14具有神经保护作用,可以使得突触联系和可塑性免受Aβ1-42的损伤。该部分研究结果与神经网络振荡活动及行为学的结果保持一致,可以从细胞、神经网络、整体三个不同层面充分证实DU-14的神经保护作用。总之,本研究在同一批动物模型上,使用Morris水迷宫试验及在体场电位记录等多种技术手段,从不同层面证实了DU-14对Aβ1-42神经毒性具有拮抗作用,并初步探讨了这一作用可能涉及到的电生理机制。本研究为DU-14等神经硫酸酯酶抑制剂用于AD的预防或治疗提供了初步的实验依据。