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第一部分MAGE-A9在上皮性卵巢癌中的表达与临床意义目的:黑色素瘤相关抗原A9(melanoma-associated antigen A9,MAGE-A9),是一个在许多不同类型的的人类癌症中特异性高表达的蛋白,并且被广泛认为是肿瘤免疫治疗的一个重要靶点。然而,MAGE-A9在上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)中的表达情况及具体作用迄今尚未研究。本研究旨在检测MAGE-A9在上皮性卵巢癌中的表达水平,并评估其表达在人类上皮性卵巢癌中的临床意义。方法:用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)在人类上皮性卵巢癌组织、正常卵巢、输卵管组织以及良性卵巢肿瘤组织中检测MAGE-A9的表达,并结合随访资料,用Kaplan-meier生存曲线和Cox回归分析评估EOC的预后。结果:MAGE-A9的表达在卵巢癌组织中明显高于正常卵巢、输卵管及良性卵巢肿瘤组织。免疫组织化学染色结果提示MAGE-A9蛋白在卵巢癌组织中高表达,阳性染色主要位于细胞浆内。本实验发现MAGE-A9蛋白高表达与卵巢癌患者FIGO分期,组织学分级,CA-125水平和肿瘤转移显著相关(P<0.05),而与其它病理学参数无关。Cox回归分析和Kaplan-Meier生存曲线显示EOC患者癌组织中MAGE-A9高表达是独立的预后因素。结论:研究表明检测MAGE-A9表达的高低可以作为评估EOC患者预后情况的生物学标志物。MAGE-A9高表达预示EOC患者的不良预后。第二部分MAGE-A9基因对上皮性卵巢癌生物学行为的影响及化疗耐药的作用目的:研究MAGE-A9在卵巢癌细胞株中的表达情况,探讨干扰及过表达MAGE-A9对卵巢癌细胞株生物学行为的影响及对化疗耐药的作用,为阐明卵巢癌的发病机制,寻求有效的针对卵巢癌治疗策略提供理论和实验依据。方法:通过qRT-PCR和免疫印记(Western Blot)检测卵巢癌细胞株HO-8910、A2780和SK-OV3中MAGE-A9 mRNA及蛋白的表达,选择MAGE-A9高表达的HO-8910细胞株,构建shRNA载体,对HO-8910细胞株采用qRT-PCR和免疫印迹检测转染shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4及shRNA-NC后细胞中MAGE-A9的mRNA和蛋白表达的变化。将HO-8910细胞株分为正常组,shRNA组,shRNA+NC组,顺铂组,shRNA+顺铂组五组予以转染处理,通过MTT、细胞划痕和侵袭实验来探讨shRNA-3转染后对肿瘤细胞增殖、存活及侵袭和转移能力的影响以及与顺铂联合作用后对细胞生物学行为的影响,免疫印迹检测其对凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白和EMT相关蛋白的影响;选择MAGE-A9低表达的A2780细胞株,构建MAGE-A9过表达载体,将A2780细胞株分为正常组、空载体组、MAGE-A9过表达组、空载+顺铂组及MAGE-A9过表达+顺铂组予以转染处理,MTT试验、细胞侵袭实验和细胞划痕实验来检测MAGE-A9过表达后对肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭和转移能力的影响以及与顺铂联合作用后对细胞生物学行为的影响,免疫印迹检测其对凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白和EMT相关蛋白的影响。结果:1.qRT-PCR和免疫印迹检测各卵巢癌细胞株中MAGE-A9 mRNA及蛋白的表达,发现MAGE-A9在HO-8910细胞株中高表达,差异有统计学意义(P<0.05);发现MAGE-A9在A2780细胞株中低表达,差异有统计学意义(P<0.05)。2.将构建的5种shRNA载体转染MAGE-A9高表达细胞株HO-8910后,检测对MAGE-A9基因表达的影响,发现转染shRNA-3抑制MAGE-A9基因的表达最佳,差异有统计学意义(P<0.05)。3.MAGE-A9高表达细胞株HO-8910转染shRNA-3,MTT试验提示干扰MAGE-A9表达后可使肿瘤细胞增殖能力受到抑制。对比正常组、shRNA组、shRNA+NC组、顺铂组及shRNA+顺铂组,结果发现:shRNA组,顺铂组及shRNA+顺铂组肿瘤细胞的增殖能力明显下降,较对照组差异有统计学意义。而且shRNA联合顺铂给药后抑制肿瘤细胞增殖更明显,且存在时间依赖性,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞体外侵袭实验提示,干扰MAGE-A9表达后可抑制肿瘤细胞迁移,比较正常组,shRNA组,shRNA+NC组,顺铂组及shRNA+顺铂组,结果发现:shRNA组,顺铂组及shRNA+顺铂组肿瘤细胞的迁移能力明显下降,较对照组差异有统计学意义。而且shRNA联合顺铂给药组的细胞数明显低于其余各组,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕试验中,shRNA+顺铂组细胞的划痕愈合速度较慢,表明shRNA载体shRNA-3能有效的抑制肿瘤细胞的迁移能力,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫印迹检测结果发现,转染shRNA-3和加入顺铂后可以上调p53,PARP和Caspase3的表达,促使癌细胞凋亡,差异有统计学意义(P<0.05);同样HO-8910细胞中转染shRNA-3单独或联合加入顺铂作用后,下调Akt,LC3B,P62,Vimentin和Ki67蛋白表达,加速癌细胞的凋亡,调节细胞的自噬及EMT的进展,差异有统计学意义(P<0.05)。4.MAGE-A9低表达细胞株A2780转染MAGE-A9过表达载体,MTT试验提示A2780细胞株中MAGE-A9过表达后促进了肿瘤细胞的增殖,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞体外侵袭实验提示,MAGE-A9过表达后促进了细胞的侵袭,MAGE-A9过表达组的细胞数明显多于顺铂组和MAGE-A9过表达联合顺铂组,MAGE-A9过表达联合顺铂组的细胞数介于两者之间,但仍明显少于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕试验中,MAGE-A9过表达组细胞的划痕愈合速度较快,表明过表达MAGE-A9后能有效的促进肿瘤细胞的迁移能力,差异有统计学意义(P<0.05)。由免疫印迹检测可知:MAGE-A9过表达后会抑制肿瘤细胞的凋亡,增加肿瘤细胞的自噬情况,MAGE-A9、Vimentin和Ki67蛋白表达升高,顺铂促进细胞凋亡(p53和Caspase3表达升高),减少细胞自噬(Akt、LC3B和p62表达下降),顺铂作用下MAGE-A9、Vimentin和Ki67蛋白表达明显下降;MAGE-A9过表达联合顺铂给药组的各蛋白表达介于MAGE-A9过表达和顺铂单独作用组之间,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.干扰MAGE-A9的表达能有效的抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移,并显著增强顺铂的化疗敏感性。2.干扰MAGE-A9联合顺铂给药后会增加细胞的凋亡,减少细胞的自噬作用。3.MAGE-A9的过表达会增强卵巢癌细胞株A2780的恶性生物学能力,包括高水平增殖能力、低水平细胞凋亡或细胞死亡能力、并增强顺铂的耐药性。