研究背景和研究目的 结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)最早是从人脐静脉内皮细胞条件培养基中发现的一种相对分子量为38kDa的分泌性生长因子，属于即刻早期基因(immediate early gene)家族—CCN家族成员之一。此后，研究发现CTGF广泛存在于人类多种组织器官中，多种细胞都可表达CTGF，如成纤维细胞、部分血管内皮和平滑肌细胞、某些上皮细胞和肿瘤细胞以及软骨细胞等。CTGF的主要生物学作用包括促进有丝分裂和细胞增生、细胞移行、诱导细胞粘附和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成等。因此，CTGF作为组织过度纤维化、瘢痕愈合和创伤修复的可能的关键因子，以及在血管形成、肿瘤生长、发育分化等方面的作用，近来受到较多的关注。研究发现转化生长因子-β(TGF-β)可刺激多种细胞分泌CTGF，CTGF是TGF-β的部分生物学功能的下游调节因子。 增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)是孔源性视网膜脱离及其视网膜复位手术后的并发症，也是手术失败的主要原因。既往研究证明视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)细胞是参与PVR的主要细胞，PVR是视网膜脱离后RPE细胞损伤的一种自我修复过程，是一种过度的眼内创伤修复反应；RPE细胞在正常位置上处于静止状态，而在某些病理条件下，如视网膜裂孔形成和视网膜脱离后，RPE细胞脱离原位，开始去分化、移行、增生、发生表型转化并分泌胶原等ECM，最终在视网膜前后表面和玻璃体内形成具有收缩能力的增生膜，造成牵拉性视网膜脱离。有多种蛋白和生长因子参与第四军医大学博士学位论文了这个过程。但是对PVR发生发展过程中，RPE细胞的生长调控机制仍有许多细节不明，影响了对PVR防治的进展。 CTGF广泛的生物学作用与PVR病理过程中RPE细胞的变化有许多一致性，既往研究发现PVR增生膜上有CTGF蛋白和mRNA的表达;但是目前体外培养的RPE细胞表达CTGF、CTGF对RPE细胞的生物学功能的影响以及CTGF作用的信号传导通路等更深一步的研究尚未见报导。本实验目的旨在从临床标本和体外实验方面，研究CTGF在尸VR增生膜中的表达和TGF一p受体、ECM的关系;研究CTGF在体外RPE细胞的表达及调控;CTGF对RPE细胞移行、粘附、增生及合成ECM的影响;同时观察CTGF对RPE细胞CaZ+信号通路的影响，探讨CTGF在PVR病变中的作用。方法1.应用SABC免疫组织化学方法观察PVR增生膜中CTGF、TGF一p受体11 (TGF一p RH)、纤维连接蛋白(FN)和I型及m型胶原的表达，原位杂交方法观察CTGF、TGF一p Rll mRNA的表达，并用免疫荧光双标记方法鉴定CTGF阳性细胞来源，探讨PVR病变过程中CTGF与TGF一日受体、ECM表达之间的相关性。2.①应用免疫荧光细胞染色、Western blot、RT一PCR方法观察RPE细胞中CTGF蛋白和基因的表达及不同刺激条件对其表达调控;②利用体外培养的单层RPE细胞损伤愈合模型，模拟PVR病程中RPE细胞的增生和移行反应，用Western blot和原位杂交方法，观察CTGF在即E细胞创伤愈合中的表达。3.①利用单层培养即E细胞损伤愈合模型，研究重组人CTGF因子(rhCTGF)对即E细胞移行及地塞米松(DEx)对CTGF诱导的细胞移行的影响;②将CTGF蛋白与多聚赖氨酸(PLL)、胶原分别包被培养板，观察CTCF促进RPE粘附的作用;③用MTT比色实验、流式细胞仪(FCM)测定RPE细胞增生反应;④用激光扫描共聚焦显微镜(LsCM)测定cTGF及联合应用8一澳一cAMP或DEX对fluo一3/AM负载的即E细胞内游离CaZ‘浓度([Ca，‘〕i)的影响。4.①用3H一月甫氨酸掺入实验测定rhCTGF、CTGF联合8一澳一cAMP对培养人RPE细胞合成胶原蛋白的影响，观察瞬时转染CTGF反义寡核昔酸(ASODN)对TGF一日1诱导胶原蛋白合成的影响;②用RT~PCR方法观察rhCTGF调控RPE第四军.医大学博士.学位论文的ECM表达以及转染CTGF反义寡核昔酸对TGF一日1诱导的FN、m型胶原mRNA的影响。结果1.PVR增生膜中CTGF、TGF一p Rll的蛋白和mRNA高表达，免疫组化显示C级膜中二者阳性表达率分别为70.6%和76.5%，D级膜中阳性表达率分别为73.9%和69.6%。原位杂交方法显示C级和D级膜中CTGFmRNA阳性表达率分别为62.5%和75%，TGF一p R H mRNA阳性表达率分别为 77.8%和71.4%，统计学分析CTGF、TGF一p Rll各级阳性表达率与膜分级间无相关性(P>0.05)。免疫荧光双标记证明CTGF阳性表达的细胞主要是RPE细胞，正常人眼球RPE层弱表达CTGF。PvR膜中FN、I型和m型胶原染色见实质细胞和细胞外间质均有表达，统计学分析CTGF与TGF一p RJI、FN、I型及m型胶原的表达有正相关性。2.①免疫荧光染色结果显示，10%血清培养的即E细胞CTGF染色呈现阳性反应;3Ong/m LTGF一日1刺激24小时，胞浆内呈现明亮的黄绿色荧光，表达强阳性信号;30ng/mL TNFa作用组呈现弱阳性信号。TNFa联合TGF-pl刺激的RPE细胞荧光强度与10%血清对照组无明显差异。计算机灰度扫描分析RT一PCR灰度值，结果显示10，20，30ng/mL TGF一pl分别使CTGFmRNA水平上调至对照组的1 .73倍、2.01倍和2.49倍，呈剂量依赖性;相反，TNFa剂量依赖性下调10%血清诱导的CTG而RNA的表达，三种剂?