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谷氨酰胺转胺酶（Transglutaminase, EC2.3.2.13, TGase），能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与赖氨酸ε-酰基或其他酰基反应，形成ε-（γ-谷氨酰基）赖氨酸共价键。特殊的催化能力使TGase广泛应用于食品工程、纺织与皮革加工、材料工程、生物医药等领域。与其它来源TGase相比，链霉菌TGase催化活性不依赖于钙离子，且作用底物广泛，是商品化TGase的主要来源。然而，链霉菌TGase存在催化活性低、热稳定性差等缺点，严重制约了其工业应用。制备高效、稳定的TGase一直以来是国内外研究者关注的热点。实验室前期筛选得到一株高产TGase的吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）WSH03-13，并确定其以酶原（pro-TGase）形式分泌，在胞外被活化蛋白酶切除N端前导肽后转化为成熟TGase。本论文以S. hygroscopicus pro-TGase重组大肠杆菌表达系统为改造平台，分别对TGase前导肽、成熟酶N端和C端区域进行改造，使其催化活性和热稳定性显著提高，并对相关机制进行分析和讨论。主要研究结果如下：（1） S. hygroscopicus TGase前导肽功能分析S. hydroscopicus pro-TGase模拟结构显示，前导肽由N端转角(turnS11-G17)和-螺旋L18-N30、及C端-螺旋R37-S42和loopL43-P57组成。前导肽N端氨基酸Y12，N27，N30和R32与成熟酶之间形成7个氢键，将上述4个氨基酸分别置换成A，对应pro-TGase突变体Y12A仅以包涵体形式存在，而其余突变体胞外pro-TGase分泌量也明显降低。但缺失前导肽C端loopL37-42，pro-TGase突变体分泌量提高70%。而缺失-螺旋R37-S42，对应TGase分泌量无提高，但比酶活增加12.3%。将-螺旋R37-S42分别替换成短肽AAA或GGG，对应TGase比酶活分别提高22.2%和24.8%，且前导肽切割效率提高2倍。上述结果表明，前导肽对TGase分泌和催化活性具有重要影响。（2）前导肽C端插入短肽提高TGase催化活性和热稳定性将短肽GG、GGG、GGGG、GGGGS和PTPPTTPT分别插入至前导肽C端切割位点上游，即L53的N端，获得一系列pro-TGase突变体。其中插入短肽GGGGS和PTPPTTPT对应的突变体TGase比酶活分别提高26.1%和35.3%。将来源于pro-TGase分子内部的11个短肽分别插入至L53的N端，其中插入短肽SPARPGESW和KTIWTHANH对应突变体TGase比酶活均提高40%，且后者50℃半衰期（t1/2（50℃））提高90%。（3） TGase N端氨基酸缺失及饱和突变提高TGase催化活性和热稳定性缺失TGase N端前4个氨基酸，相应突变TGase （Del1-4）比酶活提高32.9%；但缺失N端前5个或更多氨基酸，TGase比酶活下降至70%以下。在缺失TGase N端4个氨基酸之后，对其第5个氨基酸E62进行饱和突变，其中突变体Del1-4/E62D比酶活和t1/2（50℃）较野生酶分别提高90%和1.7倍。圆二色谱（CD）分析显示，Del1-4/E62D二级结构并无明显变化，但其熔解温度（Tm）较野生酶（68.9℃）提高10.2℃。模拟结构分析表明，TGase N端氨基酸和loop335-346之间的距离、疏水作用、电荷分布对TGase催化活性和热稳定性具有重要作用。（4） TGase C端氨基酸功能鉴定及融合短肽提高酶热稳定性缺失TGase C端第1个氨基酸（S389），对应TGase比酶活无明显变化；但缺失前2个（W388-S389）或更多氨基酸，TGase检测不到催化活性。结构模拟显示，W388与TGaseN端氨基酸D76、A77和Y78形成氢键。将W388突变为A388，突变体TGase比酶活与热稳定性下降50%，表明W388与N端氨基酸之间氢键影响了TGase催化活性和热稳定。为提高TGase稳定性，将RNase HI的C端短肽（IGCIILT）融合至TGase C端，融合酶TG-tag1的t1/2（50℃）由3.7min延长至9.1min。CD、荧光光谱及结构模拟分析表明，TG-tag1整体结构无明显变化，但其表面疏水度有明显提高。上述结果表明，TGase表面疏水性对其稳定性具有重要作用。（5）重组大肠杆菌高密度发酵生产S. hygroscopicus pro-TGase综合上述正突变，利用突变点之间的协同作用，构建得到TGase正突变体Del1-4/E62D-tag1，比酶活为26.8U/mg，t1/2（50℃）为11.2min，分别是野生酶1.8和3倍。将表达Del1-4/E62D-tag1的重组大肠杆菌在3L发酵罐上进行分批和高密度发酵。分批发酵中，重组菌发酵上清液最高酶活达14.8U/mL （48h）。高密度发酵中，利用指数和恒速两步流加策略，使重组大肠杆菌菌体密度（OD600）提高至120，通过优化诱导起始菌浓，胞外最高酶活可达32.5U/mL。在此基础上，采取甘氨酸和钙离子两步添加策略，胞外酶活进一步提高至47.4U/mL。