布鲁氏菌病是由革兰氏阴性菌布鲁氏菌引起的人畜共患慢性传染病,主要引起家畜流产、睾丸炎,人感染后会出现波浪热、关节炎,慢性患者会丧失劳动能力,给畜牧业带来了严重的经济损失也极大地危害着人类的健康。目前,没有安全可靠的人用布病疫苗,畜用布病疫苗使用最广泛的是弱毒活疫苗,但普遍存在毒力强、免疫时效短、易感染孕畜、干扰血清学免疫诊断等问题。布鲁氏菌的胞内生存机制以及致病机制还不清楚,不产生内毒素,依靠其毒力基因完成其胞内生存与繁殖机制。随着分子生物学技术的发展,布鲁氏菌毒力基因缺失疫苗有望成为控制布病疫情的新型安全有效的基因疫苗,成为了当下布病疫苗的研究热点。目前,布鲁氏菌基因缺失疫苗都是采用传统的同源重组技术对布鲁氏菌的毒力基因进行缺失,但是由于同源重组技术自身的局限性,限制了其在实验研究中的发展。近年来,一种新型、高效的基因编辑技术,CRISPR-Cas9系统能够进行精确高效的基因敲除或者修饰,已经广泛应用于动植物等真核生物以及部分原核生物如大肠杆菌、根瘤农杆菌等细菌的基因编辑。到目前为止,该基因编辑系统还没有在布鲁氏菌中进行基因编辑的报道。本研究的目的是探究CRISPR-Cas9技术在布鲁氏菌中进行基因编辑的应用情况,为布鲁氏菌基因功能研究提供平台,也为开拓更高效、便捷的布鲁氏菌毒力基因编辑技术提供理论基础。在本研究中,我们首先验证了表达CRISPR-Cas9系统基本元件(pBBR1复制子、pcat启动子)在布鲁氏菌中是否能够正常表达。通过构建载体质粒验证了泛宿主pBBR1复制子及pcat启动子在布鲁氏菌中可以正常发挥作用。之后,我们将CRISPR-Cas9系统构建于载体质粒中,验证了Cas9蛋白在布鲁氏菌中可以正常表达,并且可以切割布鲁氏菌基因组使布鲁氏菌致死。由于布鲁氏菌中缺乏非同源末端连接修复机制,因此将同源修复序列亚克隆至CRISPR-Cas9表达载体中,同时,为了克服质粒残留带来的鉴定干扰问题,以及防止DNA污染以及抗性基因引入带来的生物安全问题,将自杀基因sacB基因亚克隆至CRISPR-Cas9表达载体中,至此,基因敲除同源修复自杀质粒构建完成,将该质粒转化至布鲁氏菌感受态中,利用10%蔗糖进行质粒消除后,利用PCR技术、测序鉴定待检缺失株都为假阳性,都为‘escapers’。1、以质粒pBBR1MCS-5为载体骨架,以pBBR1为复制子,以质粒pZK001-szk001为模板克隆pcat启动子、rrnB T1 terminator、大肠杆菌ColE1复制子,以质粒pET28a为模板克隆lacI基因,构建诱导型穿梭载体质粒。以pXG-10sf质粒为模板克隆lacZ&gfP基因,利用酶切酶连方法连接到载体上,以gfP为报告基因检测诱导型pcat启动子在布鲁氏菌中的表达情况。2、以质粒p ZK35为模板克隆cas9基因的CDS以及sgRNA骨架,利用酶切酶连技术将CRISPR-Cas9元件连接至载体质粒中,以布鲁氏菌国际标准株16M基因组为模板,利用生物学软件设计布鲁氏菌hfq基因的sgRNA dimer,利用酶切酶连方法连接至诱导型表达CRISPR-Cas9质粒上,分别将表达CRISPR-Cas9-sgRNA(targeting hfq)质粒、CRISPR-Cas9-sgRNA(nonspecific)质粒转化至16M布鲁氏菌感受态细胞中,检测CRISPR-Cas9在布鲁氏菌中能否发挥有效的基因编辑功能。Western blot结果显示Cas9蛋白在布鲁氏菌中能够正常表达,转化结果显示Cas9蛋白能够切割布鲁氏菌基因组。3、以质粒pK18mobSacB为模板克隆sacB基因,然后以布鲁氏菌国际标准株16M基因组模板克隆靶基因hfq的上下游同源臂,分别利用酶切酶连、Infusion技术将靶基因的同源修复序列、sacB基因,构建至诱导型CRISPR-Cas9表达载体中,构建完整的基因敲除同源修复自杀质粒。利用电转化方法将该质粒转化入布鲁氏菌16M布鲁氏菌感受态细胞,利用终浓度为1mmol/L的IPTG诱导CRISPR-Cas9的表达进行靶基因的切割,最后利用终浓度为10%蔗糖将质粒消除。利用PCR技术、测序检测无质粒残留的布鲁氏菌待检缺失株。结果显示并未检测到阳性布鲁氏菌基因缺失突变株,皆为‘escapers’。同时在HDR应用探索过程中,发现当有线性化DNA或者非复制型质粒DNA与CRISPR-Cas9表达质粒共转时,‘escapers’的数量呈现显著性地增加。初步推测,布鲁氏菌中可能含有类似于anti-CRISPR-Cas9系统存在,在特定的条件被诱导激发,导致‘escapers’数量的显著增加。