论文部分内容阅读
目的探讨雌二醇（Estradiol,E2）及靶向的雌激素受体R1（Estrogen receptor 1,ESR1,ERα）对软骨细胞C28I2增殖的影响及可能的分子机制。本研究为进一步探讨ESR1基因的生物学功能奠定基础,也为探讨软骨相关疾病提供一定的实验基础和理论依据。方法应用Ad-Easy腺病毒载体系统构建和包装过表达腺病毒Ad-ESR1,免疫印迹及QPCR检测该基因在C28I2细胞中RNA及蛋白表达情况。在E2处理下,设立不同病毒感染组处理C28I2细胞,免疫印迹检测各处理组C28I2细胞的自噬、凋亡相关蛋白的表达及ERK信号通路的磷酸化水平;免疫荧光实验观察细胞内自噬流的强弱;FCM检测各组细胞凋亡率及周期;QPCR检测mRNA水平增殖相关标志基因PCNA（Pr oliferating Cell Nuclear Antigen）、细胞周期蛋白B1（CyclinB1）和细胞周期蛋白D1（CyclinD1）表达。腺病毒处理体外培养的小鼠跖骨,阿尔新蓝-茜素红染色来观察处理5天后跖骨全长和矿化长度。ERK特异性抑制剂U0126处理细胞,免疫印迹检测抑制ERK通路后自噬及凋亡相关蛋白表达,QPCR检测增殖相关标志基因表达。结果成功构建和包装过表达腺病毒Ad-ESR1（滴度=2×108 PFU/mL）。高浓度E2(10-5mol/L、10-6mol/L)处理C28I2细胞对自噬有所抑制,细胞凋亡蛋白表达水平有所增加,而低浓度E2(10-9mol/L)处理C28I2细胞上调LC3和ATG7的表达,降低凋亡相关蛋白表达。低浓度E2联合Ad-ESR1处理C28I2细胞,可以进一步增强LC3和ATG7的表达,促进LC3和LAMP1的融合,抑制Cleaved caspase3、Cleaved caspase12的表达并且促进PCNA、CyclinB1和CyclinD1表达,且细胞内pERK明显减少;Ad-ESR1处理组小鼠跖骨全长及矿化区都有所增长。采用siRNA技术抑制ESR1表达后,联合E2处理C28I2细胞,ESR1-siRNA一方面降低了E2促进自噬的作用,另一方面减少了E2对细胞凋亡的抑制作用,细胞的增殖水平下调,细胞内pERK相对增加。采用特异性抑制剂阻断ERK信号通路的活化之后,E2靶向ESR1的各项生物学作用均被抑制。结论不同浓度的E2对C28I2软骨细胞的生物学作用有所差异;E2与ESR1的靶向结合可以通过促进自噬、抑制凋亡进而促进软骨细胞的增殖;ESR1参与调节软骨内骨形成过程;E2靶向ESR1调控增殖的这一生物学作用与ERK信号通路相关。