苦瓜种子胰蛋白酶抑制剂分离纯化及生物活性研究

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:numlof
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本文研究了苦瓜种子胰蛋白酶抑制剂(BGTI)的分离纯化方法和生物活性,确定了利用纯水浸提、热变性沉淀、硫酸铵分步盐析、固相化胰蛋白酶亲和柱特异性吸附等最佳提取方法,通过对BGTI的物理化学性质分析,以斜纹夜蛾、菜粉蝶和小菜蛾幼虫进行生物活性实验,以及对菜粉蝶和斜纹夜蛾幼虫中肠胰蛋白酶进行的BGTI抑制活力测定试验,进一步探讨了BGTI在应用于植物抗虫基因工程上的可行性。本研究在理论以及应用方面都作了一定的研究,为植物抗虫基因工程抗虫元件的筛选提供了一定的参考价值。主要结果如下: (1)以1:10(m/v)倍体积纯水在4℃条件下浸提12h,对浸提液100℃加热变性10min,除去杂蛋白,离心去沉淀,收集上清液。在0℃条件下,采用硫酸铵0-60-90%饱和度分步盐析,收集60-90%阶段蛋白沉淀,透析除盐,得到BGTI粗提物。粗提物经胰蛋白酶—琼脂糖亲和柱特异吸附,采用改变洗脱液极性的方法将BGTI洗脱下来,收集得到的活性成分再经分子筛凝胶过滤层析,即得到BGTI纯品。经SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其分子量为43KD。 (2)以BGTI涂抹芥兰叶片,饲喂菜粉蝶、斜纹夜蛾和小菜蛾幼虫,研究BGTI的生物活性。实验结果表明,随着BGTI浓度的增加和取食时间的延长,其对上述3种蔬菜害虫都表现出明显的拒食作用和生长发育抑制作用。 (3)通过幼虫饲喂试验,然后活体解剖,测定幼虫中肠胰蛋白酶活力,分析短期和长期取食BGPI后菜粉蝶和斜纹夜蛾幼虫中肠胰蛋白酶活力变化。实验结果表明,随着取食时间的延长,两种试虫中肠胰蛋白酶活力都逐渐降低。且菜粉蝶幼虫中肠胰蛋白酶活力在较短时间内迅速降低,抑制效果明显要好于斜纹夜蛾。 (4)通过幼虫中肠胰蛋白酶离体试验,分析菜粉蝶和斜纹夜蛾幼虫中肠胰蛋白酶在离体条件下BGTI对其作用效果。结果表明随着抑制剂浓度增大,两种试虫中肠胰蛋白酶活力均逐渐降低。
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