【摘 要】
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甾体化合物的生物脱氢在甾体药物的生产中有重要的作用。3-甾酮-Δ1-脱氢酶（KsdD）具有较高的催化效率和选择性,能够催化AD（1,4-雄烯-3,17-二酮）生成ADD（1,4-雄烯-3,17-二酮）,但游离酶稳定性低,限制了其工业应用,固定化酶可以解决这种问题。本实验将野生型KsdD及其两个突变体通过共价结合的方式分别固定在环氧树脂载体上,通过对固定化条件及转化工艺的优化,实现其在生物脱氢中的连
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甾体化合物的生物脱氢在甾体药物的生产中有重要的作用。3-甾酮-Δ1-脱氢酶（KsdD）具有较高的催化效率和选择性,能够催化AD（1,4-雄烯-3,17-二酮）生成ADD（1,4-雄烯-3,17-二酮）,但游离酶稳定性低,限制了其工业应用,固定化酶可以解决这种问题。本实验将野生型KsdD及其两个突变体通过共价结合的方式分别固定在环氧树脂载体上,通过对固定化条件及转化工艺的优化,实现其在生物脱氢中的连续应用。本实验的研究结果为:（1）确定最佳的固定化条件,确定共价固定化载体为环氧树脂ES1,缓冲液Na H2PO4-Na2HPO4的最适p H为6.5,缓冲液Na H2PO4-Na2HPO4的最适浓度为1.5 M,最佳的固定时间为12 h,酶与环氧树脂载体的最适添加例为2.5 mg酶/g树脂。（2）底物特异性研究表明AD为野生型固定化酶KsdD的最适底物;对固定化酶KsdD的温度和p H的活性和稳定性,有机溶剂的稳定性等酶学性质进行了分析,与游离酶不同,固定化酶KsdD的最适的催化反应温度为25℃,在小于45℃下反应时,活性依然能够保持在85%以上,温度稳定性研究表明,在25℃-35℃下保温2 h,KsdD酶活性能保留85%以上;最适催化的缓冲液为PBS（p H 7.5）,p H稳定性研究表明,将固定化酶KsdD置于p H 7.5-8.5缓冲液中1 h,其残余相对酶活保持90%,固定化酶KsdD在有机溶剂（20%甲醇）中具有较高的耐受性。（3）固定化酶生物催化脱氢的最佳工艺条件为:AD的浓度为0.8 mg/m L,最适合溶解底物AD的溶剂为无水甲醇（6%）,转化时间2 h,转化率可达90%以上。（4）以同样的固定化条件对突变体W299A和W299G进行了固定化处理,W299A表现出最高的催化性能,酶动力学研究表明,突变型W299A固定化酶的底物亲和力最高,其次是突变型W299G固定化酶,野生型固定化酶的底物亲和力最弱。（5）研究了野生型和突变型酶W299A和W299G的储存稳定性和重复使用性,固定化W299A在4℃孵育30天后仍保持了自身初始活性的66.3%,并且比游离的KsdD更稳定,15个重复反应结束后,固定化的突变体W299A、W299G和野生型KsdD分别保持了其初始活性的70.5%、65.7%和38.7%。固定化酶W299A的稳定性高,催化效率高,重复反应的效果好,是一种很有前途的甾体脱氢生物催化剂。
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