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1研究目的建立线虫一多重耐药鲍曼不动杆菌感染模型,为下一步研究鲍曼不动杆菌致病机制及从整体动物水平观察药物抗菌效果奠定实验基础。2实验方法2.1线虫同期化处理将孕虫洗脱至15ml离心管中,洗涤,离心,弃上清液,调整溶液至3.5ml;加入1.5ml线虫裂解液进行裂解;再用M9 buffer洗涤3次。20℃过夜培养,获得L1期幼虫。将LI期线虫转接至新的线虫培养板,于20℃培养48h至L4期。2.2感染平板的制备将待测菌稀释为1.2 × 10~9CFU/mL,吸取100μL菌悬液到10cm平板上,用无菌涂布棒将菌液均匀地涂布在NGM平板上,但不要涂到平板边缘。室温下干燥20min后,置于37℃培养8h,冷却至室温待用。2.3线虫固体致死实验在每块感染平板上转接10条L4期线虫,其中为了防止N2线虫繁殖,在感染平板中滴加一定浓度的FUDR,其中E.coliOP50为实验对照组,每组均含10块感染平板。20℃培养每24h观察一次线虫的存活,当其身体僵直且对触碰无反应则判定为死亡。2.4线虫液体致死实验2.4.1不同浓度的MRDAB对线虫的致死实验将约20-30条L4期线虫转入96孔板,每孔加入40ul含有一定浓度细菌的LB溶液、160ulM9缓冲以及0.2mmoml/LFUDR。其中感染组分别加入40ul浓度为1.2× 107、1.2 × 108、1.2 × 10~9的MRDAB,阴性对照组加入40ul浓度为 1.2 × 10~9CFU/mL的E.coliOP50;空白对照组加入20%LB溶液;每种菌液做5个复孔,20℃静置培养,每24h观察一次线虫的存活。所有组均重复3次.2.4.2不同耐药程度的AB对线虫的致死实验选取终浓度1.2×10~9 CFU/ml不同耐药程度的AB感染线虫,每孔含有20-30条线虫转移至96孔板,感染组:分为A、B、C三组,分别加入菌株A(敏感菌株)、菌株B(多重耐药菌株)、菌株C(泛耐药菌株);阴性对照组:E.ColiOP50。每种菌液做5个平行,其中为了防止N2线虫繁殖,滴加0.2mmol/L的FUDR,在20℃培养指定的时间,每天记录线虫的存活数。所有组均重复3次。2.5线虫肠道内细菌计数及鉴定选取1.2 × 10~9cfu/mLMDRAB对线虫进行感染,挑取10条经感染24h的线虫,用叠氮化钠液清洗虫体3次,以抑制线虫体内细菌外逸,将虫和200ul的M9缓冲液加入1.5mlEP管中,再加入灭菌后的石英砂剧烈震荡2-3min,裂解虫体,释放细菌,取上清液进行细菌纯培养后,进行细菌重新鉴定及药敏测试。2.6线虫抗感染救治方法按2.4步骤将L4期线虫感染24h后,将感染后的线虫用用M9 buffer反复洗涤4次后,收集虫体,取20-30条感染后的线虫转移至96孔板(每孔加入LB溶液40ul,M9缓冲160ul,0.2mmoml/LFUDR及适量抗生素),每组做5个复孔,20℃静置培养。实验组:加入不同浓度抗生素:美罗培南(0、16、32、64 ug/ml)和替加环素(0、8、16和32 ug/ml);阴性对照组:不加任何抗生素,对线虫进行抗感染治疗。第一排为阴性对照,不加任何抗生素,其后各孔加其后各孔加入不同浓度的抗生素,对线虫进行感染治疗,每组实验平行做3组,每24h观察一次线虫的存活。2.7统计分析以上实验均重复3次,采用IBM SPSS Statitics 20软件进行统计分析。主要采用Kaplan-Meier方法进行生存分析,log-rank检验法对组间数据进行差异显著性分析;完全随机设计资料采用One-Way ANOVA分析进行均数比较,P<0.05为差异有统计学意义。3结果3.1线虫固体致死实验MDR-Ab平板上的线虫致死现象较OP50板明显,在感染4-6d开始不断死亡,而E.coli OP50组的线虫一般在3周后才出现死亡现象。但Ab-线虫固体致死实验存在以下缺陷,很难收集稳定可靠的数据。3.2液体致死实验3.2.1不同浓度的MRDAB对线虫的致死实验结果显示,1.2 × 107cfu/mLMDRAB组与E.coliOP50对照组的生存曲线无统计学差异(χ~2=0.148,P=0.70),提示该菌液浓度对线虫无明显致死效果;1.2×108、1.2×10~9cfu/mL MDRAB两组的生存率都低于E.coliOP50对照组,并且生存曲线与对照组均有统计学差异(χ~2分别为38.47、90.18,P值均<0.001),说明菌液浓度在1.2 × 108-1.2 × 10~9cfu/mL范围内的MDRAB对线虫有感染致死效果。将1.2× 108、1.2×10~9cfu/mLMDRAB两组进行组间比较,二者线虫生存曲线有统计学差异(χ~2=21.91,P<0.001),提示1.2×10~9cfu/mLMDRAB组对线虫的致死作用比前者更显著。3.2.2不同耐药程度的AB对线虫的致死实验结果显示,A、B、C、D线虫的生存时间均数分别为9.4、9.7、9.5、15.4天;采用log-rank检验进行水平两两比较显示,不同耐药程度的鲍曼不动杆菌对线虫致死性无统计学差异(P>0.05),但A、B、C三组均与D组的线虫生存曲线存在统计学差异(P<0.05)。提示敏感、多重耐药、泛耐药鲍曼不动杆菌均能缩短线虫寿命,能对线虫产生感染致死作用,但是不同耐药性的鲍曼不动杆菌在线虫感染模型中无明显毒力差异。3.3感染线虫肠道菌种鉴定及细菌计数将感染线虫裂解液进行细菌鉴定和药敏测试,证实为MDRAB。分别将感染MDRAB4h、8h、12h、24h后的线虫肠道裂解,并将上清液进行细菌平板计数,线虫体内菌量分别为(0.22±0.02)×105、(0.54±0.03)×105、(1.69±0.02)×105、(3.22±0.60)× 105cfu/ml。采用 One-Way ANOVA分析,不同时间点感染线虫肠道内菌量有统计学差异(F=27.32,P<0.001),说明MDRAB能够在线虫体内不断定植和繁殖,造成线虫感染致死。3.4抗生素对感染线虫的救治将不同浓度的美罗培南对感染MDRAB的线虫进行救治时发现,与未治疗组相比,16ug/mL美罗培南几乎无明显治疗效果(χ~2=2.093,P=0.148)。32ug/mL、64ug/mL的美罗培南可以提高线虫的存活率,10d后线虫存活率分别为51.7%、62.8%,与未治疗组相比存活率提高了 2～3倍(P<0.001)。将美罗培南浓度分别为32ug/mL、64ug/mL的两组进行log-rank组间比较,发现二者线虫生存曲线存在统计学差异(χ~2=7.129,P<0.05)。说明在32～64ug/mL的药物浓度范围内,美罗培南对线虫治疗有效,且疗效与药物浓度呈正相关。将不同浓度的替加环素对感染MDRAB的线虫进行救治时发现,随着替加环素治疗浓度的增加,感染线虫中位生存时间呈增加趋势。采用log-rank检验显示,8ug/ml的替加环素救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别无统计学意义(χ~2=0.105、1.4,P=0.746);16ug/ml替加环素救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别有统计学意义(χ~2=81.290,P<0.001),32ug/ml替加环素救治组与空白对照组比较的生存曲线的差别有统计学意义(χ~2=124.302,P<0.001)。说明在16-32ug/mL的药物浓度范围内,替加环素对线虫治疗有效,且疗效与药物浓度呈正相关。4结论4.1线虫液体感染法相比于固体感染法,前者更能确保实验的良好的可操作性、重复性和稳定性。4.2 MDRAB可以对线虫造成感染,但不同耐药性的鲍曼不动杆菌对线虫毒性无明显差异。4.3抗生素对感染线虫的救治实验中,线虫的生存率与抗菌药物的浓度呈正相关性,这与体外药敏实验结果相符合。