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目的：哮喘是一种由IgE介导的I型变态反应,主要特征是变应原初次进入机体诱导特异性B淋巴细胞产生IgE抗体,其Fc段与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面的高亲和力受体FcεRI结合,使机体处于对该变应原的致敏状态；当相同的变应原再次进入体内,与细胞表面受体结合型IgE结合引起表面交联,使细胞活化,释放大量生物活性介质,从而引起平滑肌收缩、腺体分泌增强等一系列过敏症状。基于IgE在哮喘疾病中的重要作用,人们一直试图通过阻断IgE与FcεRI的结合从而阻断哮喘的发生和发展。其原理是通过抗IgE抗体高度特异性地结合游离的IgE,阻断IgE与效应细胞膜表面受体作用,阻止效应细胞脱颗粒,从而达到治疗哮喘患者的目的。因此,阻止IgE分子与效应细胞表面的高亲和力受体FcεRI结合的相关药物的研究成为哮喘和过敏性疾病药物研究的热点。鉴于IgE与FcεRI的相互作用等同于IgE Fc片段(Cε3-Cε4)与FcεRI的相互作用,本实验室前期尝试采用重组人IgE C3-C4替代完整的IgE分子对抗体库进行筛选。使用300位健康志愿者的外周血淋巴细胞,建立了9×107库容的人免疫球蛋白G基因文库,同时合成了重组人IgE C3-C4蛋白,用其代替完整的IgE分子对抗体库进行筛选,成功筛选到可与IgE C3-C4特异性反应的抗IgE特异性人源抗体Fab片段,命名为lib-8。本研究旨在建立产生高水平IgE哮喘小鼠动物模型,为后期体内试验探索哮喘抗IgE抗体治疗的研究奠定基础；体、内外试验研究验证lib-8的功能和生物学活性,为后期的临床前和临床实验奠定基础；通过对lib-8三维结构的预测,探索并验证lib-8与IgE抗体的具体结合位点。方法：1.以最常见的致敏原——粉尘螨提取液致敏和激发6-8周龄C57BL/6雌性小鼠,模拟尘螨诱发产生高水平IgE的哮喘发病模型,为探索抗IgE抗体在哮喘治疗中的机理研究奠定基础。2.采用RosettaAntibody同源建模的方法构建了lib-8可变区的分子模型,对其结构进行预测。并利用分子对接的方法,将IgEC3-C4抗原与lib-8抗体进行了抗原-抗体RosettaDock分子对接,预测该抗体与IgE C3-C4抗原可能的相互作用的表位。用PCR的方法从实验室前期制备的IgEC3-C4-pET-19b表达质粒中分别获得人IgEC3, IgEC4, IgEC4-link基因,与原核表达载体pET-19b连接得到表达质粒并在大肠杆菌BL21 (DE3)star pLysS中大量表达并纯化,这些蛋白均以包涵体形式收获,参照Novagen公司的Protein RefoldingKit处理、以谷胱甘肽氧化还原系统进行复性重构,获得纯化的IgEC3, IgEC4, IgEC4-link蛋白。然后使用ELISA、免疫印迹试验(Western blotting)验证lib-8与IgE抗体的具体结合部位。3.体内试验——哮喘动物模型,以粉尘螨提取液为过敏原致敏和激发6-8周龄C57BL/6雌性小鼠,lib-8100μg/次连续腹腔注射治疗5天,第6天腹腔注射300μg治疗,验证lib-8对哮喘模型小鼠中的血清游离IgE的抑制作用。4.体外试验——P815小鼠肥大细胞脱颗粒模型,分别以小鼠anti-DNP-IgE致敏和DNP-BSA激发P815 细胞, 以4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide为底物进行荧光检测β-hexosaminidase释放率,验证lib-8抑制肥大细胞脱颗粒情况。结果：1.成功制备了高水平IgE哮喘小鼠动物模型,具有较高滴度的血清总IgE和重组二类粉尘螨变应原特异性IgE(rDer f2-sIgE)水平,为哮喘抗IgE抗体治疗的研究提供了良好的基础。具体表现为小鼠的BALF中的细胞总数和嗜酸性粒细胞均显著增多(P<0.01)；细支气管以及伴行血管周围有明显的炎症细胞浸润；血清总IgE(P<0.001)和rDer f2-sIgE(P<0.01)水平显著升高；BALF中IL-4的水平显著增高(P<0.05),而IFN-γ的水平显著降低(P<0.01)。2.成功获得提纯的人IgE C3,IgE C4,IgE C4-link蛋白,ELISA、Western blotting验证了lib-8的结合部位是人IgECe3区域。3.体内试验验证了lib,8对哮喘具有明显的治疗作用。具体表现为与模型组相比治疗组小鼠的BALF中的细胞总数和嗜酸性粒细胞均显著减少(P<0.01)；细支气管以及伴行血管周围炎症细胞浸润减少：血清总IgE(P<0.01)和rDer f2-sIgE(P<0.05)水平显著降低；BALF中IL-4的水平显著降低(0<0.05),而IFN-γ的水平无显著差异。4.体外试验验证了lib-8可明显抑制肥大细胞P815脱颗粒,较模型组相比治疗组P815细胞释放P-Hexosaminidase明显减少(P<0.05)；光学显微镜400倍下观察治疗组P815细胞脱颗粒明显少于模型组。小结：成功建立了产生高水平IgE的小鼠哮喘动物模型；本实验室前期筛选得到的人抗人IgE工程抗体Fab片段,即lib-8,具有良好的反应性,它与IgE抗体的具体结合部位是Cε3区域。