细菌耐药,是指细菌能在杀死它们或削弱它们的药物中获得生存的本能。细菌耐药性的来源有两个途径,即自身基因突变和耐药基因的获得。外源性耐药基因的获取,是细菌耐药性广泛散播的主要原因,一般通过可移动遗传元件完成,如质粒、转座子、整合子、插入序列共同区(ISCR)等。质粒是一种独立的、可自我复制的遗传元件,自身可携带耐药基因,亦可作为其他可移动遗传元件的载体,介导菌株间基因水平转移,在耐药基因的扩散过程中扮演着关键角色。因此研究质粒DNA的结构,分析质粒所携带的功能基因及质粒与细菌耐药性的关系,对细菌耐药分子机制的深入研究具有重要意义。为了系统研究基因的水平转移,本课题组已选用对抗生素敏感的一株福氏志贺菌Z23作为受体菌,以临床分离的耐多药大肠杆菌E667为供体菌,通过接合转移实验构建了多重耐药转移菌株ZT,并通过抑制性消减杂交实验筛选出一部分序列,斑点杂交试验结果表明这些序列在供体菌及转移菌株的质粒上均存在,克隆转化实验发现这些序列与细菌耐药有关(故之后称这些序列为耐药相关序列)。但是含有这些耐药相关序列的质粒是否为耐药质粒,是否为接合质粒,介导供体菌和受体菌之间耐药性的传递,仍需进一步验证。故本课题将通过转化实验获得含有该质粒的转化子,分析该质粒与耐药性的关系,对该质粒上的耐药基因进行筛选,检测该质粒上所存在的与耐药相关的可移动遗传元件,以探索该质粒在耐药过程中所起的作用及其耐药机制,为更全面的了解质粒所介导的耐药分子机制提供基础资料。方法1阳性克隆的获得：通过改进分子克隆上面的质粒转化实验方法,降低预培养转速、预培养温度及延长预培养时间,将实验室储存的志贺菌属细菌质粒(该质粒来源于通过接合转移实验获得的耐多药的志贺菌属转移株ZT,供体菌为临床分离的耐多药的大肠杆菌E667,受体菌为敏感的福氏志贺菌Z23)转入感受态大肠杆菌DH-5α中,分别涂布在含单一抗生素的培养基上,抗生素包括头孢噻吩(CF)、磺胺甲噁唑(SMZ)、诺氟沙星(NOR)、庆大霉素(GM),浓度分别为最小抑菌浓度(MIC)、1/2最小抑菌浓度(1/2MIC),过夜培养18h-24h后,挑取板上的单克隆,进行菌落PCR扩增耐药相关序列T2G6(本课题组前期研究筛选的位于质粒上的耐药相关序列之一),以筛选阳性克隆。2质粒提取：将阳性克隆挑至含NOR的LB液体培养基中,过夜培养,通过离心收集菌体,进而使用Axygen生物公司的质粒小量提取试剂盒提取质粒,然后在O.5%的琼脂糖凝胶上与原质粒进行电泳比对。3药物敏感试验：以纸片法抗菌药敏试验标准及美国国立临床实验室标准委员会(NCCLS)指南为参照,采用Kin-Bauer:纸片琼脂扩散法进行药敏鉴定,抗生素药敏纸片包括：头孢噻吩(CF)、头孢唑啉(CFZ)、头孢呋辛钠(CXM)、头孢他啶(CAZ)、头孢他啶／克拉维酸(CAZL)、头孢吡肟(FEP)、头孢噻肟(CTX)、头孢噻肟/克拉维酸(CTXL)、头孢唑肟(ZOX)、头孢哌酮(CFP)、氨曲南(AZT)、磺胺甲恶唑(SMZ)、甲氧苄啶(TMP)、诺氟沙星(NOR)、阿莫西林(AMX)、氨苄西林(AMP)、氯霉素(CHL)、四环素(TET)、链霉素(STR)、庆大霉素(GM)、亚胺培南(IPM)等。所用质控菌株为大肠杆菌ATCC25922.4耐药基因筛选：根据药敏结果参考相关文献设计引物筛选质粒上可能存在的耐药相关基因：喹诺酮类耐药相关基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qurS、 qepA、aac(6’)-Ib-cr,头孢菌素类耐药相关基因blaTEM、blaSHV、blaCTX、 Ampc,磺胺耐药基因sull及氯霉素乙酰转移酶基因cat等的引物,PCR相关基因,并将获得的PCR产物送至生物公司测序鉴定,经BLAST比对后对基因进行确认。5耐药相关的可移动遗传元件的筛选：参考相关文献设计引物筛选质粒上可能存在的可移动遗传元件相关基因,包括插入序列ISEcp1、IS26、IS903、ISCR1;整合酶基因intl1、intI2及intI3;接合质粒遗传标记traA、trbC。PCR相关基因,并将获得的PCR产物送至生物公司测序鉴定,经BLAST比对后对基因进行确认。结果1质粒鉴定：通过对抗生素培养板上的单克隆进行菌落PCR耐药相关序列T2G6,在含NOR(1/2MIC)I的LB固体培养基上获得阳性克隆；质粒凝胶电泳比对结果显示转化子质粒即为所转化的志贺菌属细菌质粒。2药敏鉴定：感受态大肠杆菌对所有的抗生素敏感,转化子对CAZ、AZT耐药,对CTX、ZOX中介耐药,对其他抗生素则敏感。转化子与感受态大肠杆菌相比：CTX、CFP、ZOX、FEP、NOR、CIP、LVF、SMZ、TMP、CHL的抑菌环直径减小5mm以上；CFZ、CXM、AMP、AMX、GM、STR、TET、IPM抑菌环直径的变化在5mm内。ESBLs确证实验表明该转化子为非产ESBLs菌株。3耐药基因的筛选：该质粒上存在耐药基因TEM-116、sull及cat,未检测到喹诺酮类抗生素耐药相关基因。4耐药相关可移动遗传元件的筛选：1类整合子酶基因检测阳性：接合质粒遗传标记trbC筛选阳性：未检测到插入序列ISEcp1、IS26、IS903、ISCRl的存在结论1该质粒为广宿主接合质粒,可介导大肠杆菌与志贺菌属细菌间耐药性的传递。2该质粒为多重耐药质粒,可介导细菌对头孢类抗生素及单环内酰类抗生素耐药；与喹诺酮类抗生素、氯霉素、磺胺类等抗生素耐药性的产生有关。3该质粒上所含有的耐药基因及耐药相关的可移动元件不能完全解释其耐药表型,其作用机制有待深入研究。