一研究背景和目的药物在体内的吸收与代谢的处置过程中,存在着由外排转运蛋白和药物代谢酶共同组成的生物利用度屏障。在生理上,这一生物防御屏障能够阻碍外来物进入机体内,从而避免机体受到外来物的侵扰,但对于药物而言,则严重影响其药效与毒性。二萜类化合物中的毒效成分乌头生物碱和活性成分穿心莲内酯在临床上的使用越来越多。乌头生物碱具有局麻、镇痛、镇静、强心、抗炎、抗肿瘤等功效。然而由于其治疗剂量和中毒剂量非常接近,被中国以及其他一些国家药典列为大毒药,在临床使用过程中,中毒事件频频发生。乌头在使用前必须经过长时间的煎煮,使毒性成分较大的乌头碱(AC)、中乌头碱(MA)、次乌头碱(HA)大部分水解为毒性较小的苯甲酰乌头原碱(BAC)、苯甲酰中乌头原碱(BMA)、苯甲酰次乌头原碱(BHA)、乌头原碱(aconine)、中乌头原碱(mesaconine)和次乌头原碱。穿心莲内酯有降压、抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗心肌缺血及抗癌等作用。因此,本研究的目的是基于外排转运蛋白和药物代谢酶研究乌头生物碱和穿心莲内酯生物利用度屏障特征及分子机制,从而科学地认知穿心莲内酯的有效性和乌头生物碱的毒性与生物利用度屏障的关系,趋利避害,增加药物的疗效,减少药物毒副反应。二方法采用大鼠药代动力学模型、Caco-2细胞模型、MDR1-MDCKII细胞模型,人肝微粒体和S9反应体系,CYP酶单克隆抗体、人源化重组CYP酶、大鼠在体肠灌流模型,高效液相质谱联用技术,高分辨率质谱,核磁分析技术。统计学处理：数据用mean±SD来表示。统计软件SPSS16.0。采用统计方法Students’t-test或者One-way ANOVA进行数据分析。三结果1.乌头生物碱的药代动力学研究大鼠灌胃给药AC,MA和HA后,我们在大鼠血浆里除了检测到AC,MA和HA,还检测到BAC,BMA,BHA,aconine和nesaconine。结果表明AC,MA和HA被水解代谢。AC,MA和HA的消除半衰期(T1/2β)分别是90.8+22.7min,155±66.4min,185±46.2mmin。BAC,BMA,BHA,aconine和mesaconine的T1/2β分别是526±324min,407±180min,552+142min,685±494min,399±151min。这些结果表明AC,MA和HA在体内的消除比它们的代谢物BAC,BMA,BHA,aconine和mesaconine要快很多,这预示着毒性越大的乌头生物碱被机体消除的速率越快。2.AC,MA,HA,BAC,BMA,BHA,aconine and mesaconine在Caco-2和MDR1-MDCKII细胞中的转运我们研究了乌头类生物碱1μM在Caco-2细胞中从A(apical)到B(basolateral)方向和从B到A方向的跨膜转运。AC,MA和HA在Caco-2细胞从A到B方向转运的表观渗透系数Papp值分别是(7.63±1.16×10-7)cm/s,(8.24±0.45×10-7)cm/s和(21.5±0.72×10-7)cm/s。而AC,MA和HA从B到A方向转运的表观渗透系数Papp值显著性地高于(P<0.05)它们从A到B方向的数值。AC,MA和HA的外排转运率Er值分别是34.6+4.2,29.7±2.1和15.6±2.1。BAC,BMA和BHA在Caco-2细胞从A到B方向转运的表观渗透系数Papp值分别是(5.02±1.28×10-7)cm/s,(5.84±2.37×10-7)cm/s和(9.17±1.49×10-7)cm/s。而BAC,BMA和BHA从B到A方向转运的表观渗透系数Papp值大约是它们从A到B方向的数值的4倍(P<0.05)。它们的外排转运率Er值分别是5.2±1.4,4.5±2.4和4.4+0.9。Aconine和mesaconine在Caco-2细胞从A到B方向转运的表观渗透系数Papp值分别是(12.1±3.01×10-7)cm/s和(10.4±2.27x10-7)cm/s。Aconine和mesaconine的外排转运率Er值分别是1.1±0.4和1.1+0.5。在cyclosporine A或者verapamil的作用下,AC,MA和HA的外排现象几乎被完全抑制,外排转运率Er显著的降低(P<0.05),都降低到大约1.0。在这2个化学抑制剂的作用下,BAC,BMA和BHA的Er值都降低；aconine和mesaconine的Er值没有显著性变化。与渗透性结果相一致,AC,MA和HA在细胞内的含量,无论从A到B的方向转运还是从B到A的方向转运,都显著地(P<0.05)增加。在Cyclosporine A或者verapamil单独作用下,从A到B方向转运,AC在细胞内的含量从2pmol增加到58pmol或者60pmol;MA在细胞内的含量从1pmol增加到44pmol或者45pmol；而HA在细胞内的含量3pmol增加到90pmol或者44pmol。BAC,BMA和BHA在细胞内的含量,在化学抑制剂的作用下,也相应地有所增加。然而,aconine和mesaconine在细胞内的含量没有显著变化。]μM AC,MA和HA在MDR1-MDCKII细胞中从B到A方向的表观渗透系数显著地(P<0.05)大于它们从A到B方向的渗透系数。AC,MA和HA在MDR1-MDCKII的外排转运率Er值显著地(P<0.05)大于它们在MDCKII细胞中的值,分别是(22.2±2.6)比(1.8±0.5),(27.9±5.3)比(1.5±0.2),(10±1.3)比(1.4±0.3)。在MDR1-MDCKII细胞中,BAC,BMA, BHA,aconine和nesaconine的Er值与其在MDCKII细胞中的Er值没有显著性差异。从A到B方向转运或从B到A方向转运,AC,MA和HA在MDR1-MDCKII细胞的含量都显著地小于它们在MDCKII细胞的含量(P<0.05)；而BAC和BHA从B到A方向转运时,在这两种细胞内的含量有显著性变化。从A到B方向转运或从B到A方向转运,mesaconine在MDR1-MDCKII细胞的含量都显著地大于它们在MDCKII细胞的含量(P<0.05)。综合外排转运率和细胞内含量的变化,我们推断P-gp参与AC,MA和HA的细胞转运。在Ko143的作用下,AC,MA,HA和BAC的Er值显著地降低(P<0.05)。在Ko143作用下,从A到B方向转运,AC在细胞内的含量从2pmol增加到71pmol;MA在细胞内的含量从1pmol增加到47pmol;HA在细胞内的含量从3pmol增加到112pmol;BHA在细胞内的含量也显著增加；而BAC,BMA,aconine和mesaconine在细胞内的含量没有显著变化。综合外排转运率和细胞内含量的变化,我们推断Bcrp可能参与AC,MA和HA的细胞转运。在MK571的作用下,AC,MA和HA的Er值显著的降低(P<0.05)。BAC,BMA和BHA的Er值也显著地降低(P<0.05)。在MK571作用下,从A到B方向转运,AC在细胞内的含量从2pmol增加到81pmol;MA在细胞内的含量从1pmol增加到48pmol;HA在细胞内的含量从3pmol增加到101pmol。BAC,BMA和BHA在细胞内的含量也显著增加；而aconine和mesaconine在细胞内的含量没有显著变化。综合外排转运率和细胞内含量的变化,我们推断Mrp2可能参与AC、MA、HA、BAC、BMA和BHA的细胞转运。3.乌头生物碱体外CYP酶代谢研究中乌头碱在人的肝微粒体中至少生成9个代谢产物(M1～M9),主要的代谢途径包括去甲基,脱氢,羟基化,脱氢-去甲基。我们选用了一系列CYP酶亚型的化学抑制剂去确认参与MA代谢的CYP酶亚型。由结果推断MA的代谢主要是由CYP3A介导,CYP2C8,2C9,2C19和2D6也有一定的作用,CYP1A2和2E1几乎没有参与其代谢。接着,我们选用了一系列的人源化重组CYP酶验证参与MA代谢的CYP酶亚型。在MA的代谢中,CYP3A发挥着最重要的作用；CYP2C8,2C9,2C19和2D6发挥部分作用,CYP1A2和2E1的作用很小次乌头碱在人的肝微粒体中至少生成11个代谢产物(M1-M11),主要的代谢途径包括去甲基,脱氢,羟基化,脱氢-去甲基,脱二甲基。我们鉴定了代谢产物M8为中乌头碱。化学抑制剂、单克隆抗体和人源化重组CYP酶实验表明HA的代谢主要由CYP3A介导。CYP2C19、2D6和2E1在其代谢中也发挥部分的作用；而CYP1A2和2C8几乎不参与其代谢。4.穿心莲内酯的生物利用度屏障特征大鼠灌胃给药穿心莲内酯120mg/kg,血药峰浓度Cmax是0.23±0.05μg/mL,达峰的时间是29.75±0.5min；其后,它的消除半衰期时间T1/2β是142.30±34.48min,它的血药浓度时间曲线下面积AUC0-∞是29.45±3.73μg·min/mL而大鼠静脉尾静脉注射穿心莲内酯24mg/kg后,它的消除半衰期、清除率,血药浓度时间曲线下面积分别是157.60±74.09min,109.24±8.99ml/min/kg和220.83±18.26μg·min/mL。因此根据口服生物利用度计算公式,得到穿心莲内酯的口服生物利用度是2.67%。为了探索穿心莲内酯生物利用度低的原因,我们研究了穿心莲内酯在Caco-2细胞上的双向转运。实验结果表明穿心莲内酯从B侧到A侧转运的表观渗透系数Papp值(4.94×10。cm/s)显著地(P<0.05)高于其从A侧到B侧的数值(1.14×10-5cm/s)。穿心莲内酯的吸收渗透系数Papp值为(1.14×10。cm/s),这表明穿心莲内酯渗透性较高,跨膜容易,吸收差不是造成穿心莲内酯生物利用度差的原因。为了进一步研究清楚参与穿心莲内酯跨膜的外排转运蛋白,我们选用了MDR1-MDCKII细胞研究穿心莲内酯的跨膜情况。MDR1-MDCKII细胞过表达人的mdr-1基因,也就是P-gp。我们同时选用了P-gp表达水平较低的MDCKII细胞作为阴性对照。通过比较穿心莲内酯在这两种细胞的外排转运率,确认P-gp对穿心莲内酯跨膜的作用。穿心莲内酯在MDR1-MDCKII的外排转运率是其在MDCKII细胞的4倍,这表明P-gp介导着穿心莲内酯的跨膜,能够把穿心莲内酯从血浆中外排至肠腔,造成穿心莲内酯生物利用度低。肠道酶对穿心莲内酯有水解作用,其中十二指肠和空肠酶的水解作用较强。特别是在十二指肠中,1h内穿心莲内脂被水解了约70%,8h内几乎完全被水解；空肠中,1h内被水解了约50%。而在回肠和结肠中,肠道酶对穿心莲内酯的水解作用较弱,1h内约10%。在灌流过程中,穿心莲内酯在各肠段被吸收的量存在显著性差异(P<0.05)。穿心莲内酯的表观渗透系数(P*eff是十二指肠>空肠>回肠、结肠。由于穿心莲内酯存在代谢,扣除代谢的部分,其渗透系数有所降低,但其在肠段吸收的趋势没有改变,仍然是十二指肠>空肠>回肠、结肠。在灌流过程中,穿心莲内酯经胆汁排泄的总量是39.4nmol,约等于吸收总量的1%。为了研究清楚穿心莲内酯在各肠段吸收的差异性,我们在大鼠在体灌流模型中进一步研究了穿心莲内酯在外排蛋白P-gp的抑制剂维拉帕米和外排转运蛋白Bcrp的抑制剂双嘧达莫的作用下的各肠段的吸收。根据参考文献和抑制剂的半数有效抑制有效浓度,我们选定维拉帕米的灌流浓度为100μM,双嘧达莫的浓度为50μM,这两个浓度都远远大于它们各自的半数有效抑制浓度。我们采用上述的灌流方法,设定了三组实验,每组4只大鼠：灌流液分别是穿心莲内酯(40μM)和维拉帕米(100μM)的混合溶液；穿心莲内酯(40μM)和双嘧达莫(50μM)的混合溶液；穿心莲内酯(40μM)、维拉帕米(100μM)和双嘧达莫(50μM)的混合溶液。所得的样品根据上述方法进行分析,结果采用One-way ANOVA的分析方法进行统计。结果显示在维拉帕米的作用下,穿心莲内酯在回肠和结肠中的表观渗透系数显著性(P<0.05)地增加了,但其在十二指肠和空肠中没有显著性变化。在双嘧达莫的作用下,穿心莲内酯在各肠段的表观渗透系数没有显著性(P<0.05)变化。然而,在维拉帕米和双嘧达莫的作用下,穿心莲内酯在回肠和结肠的表观渗透系数显著性(P<0.01)地增大,但仍然没有改变其在十二指肠和空肠中的表观渗透系数,穿心莲内酯呈肠段吸收依赖性的现象消失了。在抑制剂的作用下,在灌流60min后,穿心莲内酯经胆汁排泄的量也大大地(P<0.05)增加。在穿心莲内酯灌流样品分析中,通过对比空白样品和含药灌流样品,我们在其十二指肠和空肠灌流液中的色谱图中,发现了穿心莲内酯的一个代谢产物,其保留时间是1.91min,通过高分辨质谱(Bruker,USA)测得它的精确分子量是413.1657,根据精确分子量推测得到的分子式是C20H29O7S。我们把十二指肠和空肠的灌流液冷冻干燥浓缩后,加入100%甲醇溶解,13000rpm离心30min,取出上清液。再用少量的H20/MeOH(9：1)溶液溶解,加载到自己填充好的ODS柱子(2×10cm,10μm),再用H20/MeOH(9：1)溶液洗脱,收集洗脱液,UPLC-MS/MS测定每一份洗脱液,合并含有代谢物组分的洗脱液,浓缩后,进行核磁分析(BRUKER300, in CD3OD,75MHz for13C)。在核磁分析中,它的碳信号跟先前的文献报道的物质14-脱氧-12-磺酸化-穿心莲内酯非常相似。在灌流实验中,统计分析表明,在十二指肠形成的穿心莲内酯代谢产物的量大于(P<0.05)在空肠形成的量。四结论1.药物代谢酶(CYP等)和外排转运蛋白(P-gp,Bcrp,Mrp2)形成了乌头生物碱的生物利用度屏障,保护此屏障能防止毒性的发生。2.P-gp和磺酸化酶形成了阻抗穿心莲内酯的生物利用度屏障,克服屏障作用,能提高其生物利用度。