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【目的】
1．探讨癌相关成纤维细胞对三阴性乳腺癌细胞产生免疫负调控因子的影响。
2．探讨癌相关成纤维细胞调控三阴性乳腺癌细胞PD-L1表达的机制。
【方法】
1．分离和培养三阴性乳腺癌问质成纤维细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，使用蛋门免疫印迹技术(Western Blotting，WB)检测成纤维细胞的标记分子标志物α-SMA、FSP-1、TNC、Vimentin等分子表达情况。
2．以携带端粒酶催化业基hTERT的慢病毒感染成纤维细胞，经潮霉素0筛选获得永生化成纤维细胞，以qPCR及WB技术检测感染后的成纤维细胞中hTERT、α-SMA、FAP、TNC、Vimentin等分子表达情达情况。
3．运用qPCR及WB技术检测不同三阴性乳腺癌细胞免疫抑制因了和细胞因子受体的表达情况。
4．以乳腺癌细胞条件培养基与正常成纤维细胞共培养，qPCR、WB技术分别检测成纤维细胞激活标记分了(α-SMA、FAP、Tntegrinp、TNC、NG2等)剁抑癌基因(P53、Rb、P16、PTEN)表达水平，确定共培养后成纤维细胞的激活情况。
5．qPCRarrav技术检测激活成纤维细胞中生长因子、细胞因子、趋化因子及其受体表达水平。
6．以活化成纤维细胞条件培养基共培养乳腺癌细胞，qPCR、WB技术分别检测乳腺癌细胞免疫负调控因子的表达情况。
【结果】
1．分离培养后的乳腺癌成纤维细胞在倒置显微镜先观察呈纺锤形或梭形，其分子标志物α-SMA、FAP、Incegrinβ1、TNC、Vimentin蛋白表达阳性。
2．使用hTERT慢病毒感染乳腺癌成纤维绌胞并用潮霉素筛选后，乳腺癌成纤维细胞成功永生化，能在体外多次传代，倒置显微镜下观察细胞形态无明显变化，仍呈纺锤形或梭形。WB、qPCR技术检测发现永生化的乳腺癌成纤维细胞高表达hTERT蛋白与hTERTmRNA(p＜0.01)，α-SMA、CD99、FAP、TNC、Vimentin、PTEN等蛋白在永生化前后的成纤维细胞中的表达水下并无明显差异，α-SMA存mRNA水平稍有下降(p＞0.05)。
3．运用qPCR及WB技术检测不同三阴性乳腺癌细胞免疫抑制因子和细胞因子受体发现，市日对于MCF-7免疫抑制因子PD-L1存MDA-MB-231、BT20中早现出高表达(p＜0.05)，在另外两种三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468和Hs578t中表达很低(p＜0.05)，IDO1、Siglec9、Siglec15在所有上述乳腺癌细胞中表达均很低：Glectin1在上述乳腺癌细胞中表达均很高；通过qPCR检测发现相对丁乳腺癌细胞MCF-7，趋化因子受体在上述几种乳腺癌细胞中mRNA水平均表达很低(p＜0.05)。
4．用MDA-MB-231条件培养基与上述分离的成纤维细胞共培养3d-14d后，成纤维细胞活化分子标志物FAP、Integrinβ1(CD29)、TNC在蛋白水平表达明显上调，α-SMA表达未见明显变化，PDGFRB、NG2在蛋白水平表达明显下降；抑癌基因Rb在蛋白水平呈现下降趋势，其余P16、P53、PTEN表达有所上调。
5．qPCRarray分析发现活化成纤维绌胞相对于未激活的成纤维绌胞，趋化因子CXCL8、CXCL5、CXCL2、CXCL1、CSF2、CSF3明显上调，其中CXCL5、CXCL8上调高达80多倍(P＜0.001)。
6．激活的成纤维细胞与PD-L1表达较低的三阴性乳腺癌绌胞(MDA-MB-468、Hs578t)其培养后，WB和qPCR检测蛋白和mRNA水平的PD-L1表达均上调，Siglec9在mRNA水平表达也上调；qPCR检测共培养后乳腺癌细胞CXCR2存mRNA水平表达有上调(p＜0.05)。
【结论】
体外共培养实验提示，在TNBC细胞可能通过产生可浴性细胞因子或趋化因子，使成纤维细胞巾的抑癌基因灭活，进而激活成纤维细胞成为癌相关成纤维细胞；反过来，活化成纤维绌胞又通过CXCL-X/CXCR2趋化因子信号通路促进癌细胞免疫抑制冈子PD-L1和IDO1的表达，使癌细胞产生免疫逃逸。但具体机制需要深入研究。
1．探讨癌相关成纤维细胞对三阴性乳腺癌细胞产生免疫负调控因子的影响。
2．探讨癌相关成纤维细胞调控三阴性乳腺癌细胞PD-L1表达的机制。
【方法】
1．分离和培养三阴性乳腺癌问质成纤维细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，使用蛋门免疫印迹技术(Western Blotting，WB)检测成纤维细胞的标记分子标志物α-SMA、FSP-1、TNC、Vimentin等分子表达情况。
2．以携带端粒酶催化业基hTERT的慢病毒感染成纤维细胞，经潮霉素0筛选获得永生化成纤维细胞，以qPCR及WB技术检测感染后的成纤维细胞中hTERT、α-SMA、FAP、TNC、Vimentin等分子表达情达情况。
3．运用qPCR及WB技术检测不同三阴性乳腺癌细胞免疫抑制因了和细胞因子受体的表达情况。
4．以乳腺癌细胞条件培养基与正常成纤维细胞共培养，qPCR、WB技术分别检测成纤维细胞激活标记分了(α-SMA、FAP、Tntegrinp、TNC、NG2等)剁抑癌基因(P53、Rb、P16、PTEN)表达水平，确定共培养后成纤维细胞的激活情况。
5．qPCRarrav技术检测激活成纤维细胞中生长因子、细胞因子、趋化因子及其受体表达水平。
6．以活化成纤维细胞条件培养基共培养乳腺癌细胞，qPCR、WB技术分别检测乳腺癌细胞免疫负调控因子的表达情况。
【结果】
1．分离培养后的乳腺癌成纤维细胞在倒置显微镜先观察呈纺锤形或梭形，其分子标志物α-SMA、FAP、Incegrinβ1、TNC、Vimentin蛋白表达阳性。
2．使用hTERT慢病毒感染乳腺癌成纤维绌胞并用潮霉素筛选后，乳腺癌成纤维细胞成功永生化，能在体外多次传代，倒置显微镜下观察细胞形态无明显变化，仍呈纺锤形或梭形。WB、qPCR技术检测发现永生化的乳腺癌成纤维细胞高表达hTERT蛋白与hTERTmRNA(p＜0.01)，α-SMA、CD99、FAP、TNC、Vimentin、PTEN等蛋白在永生化前后的成纤维细胞中的表达水下并无明显差异，α-SMA存mRNA水平稍有下降(p＞0.05)。
3．运用qPCR及WB技术检测不同三阴性乳腺癌细胞免疫抑制因子和细胞因子受体发现，市日对于MCF-7免疫抑制因子PD-L1存MDA-MB-231、BT20中早现出高表达(p＜0.05)，在另外两种三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468和Hs578t中表达很低(p＜0.05)，IDO1、Siglec9、Siglec15在所有上述乳腺癌细胞中表达均很低：Glectin1在上述乳腺癌细胞中表达均很高；通过qPCR检测发现相对丁乳腺癌细胞MCF-7，趋化因子受体在上述几种乳腺癌细胞中mRNA水平均表达很低(p＜0.05)。
4．用MDA-MB-231条件培养基与上述分离的成纤维细胞共培养3d-14d后，成纤维细胞活化分子标志物FAP、Integrinβ1(CD29)、TNC在蛋白水平表达明显上调，α-SMA表达未见明显变化，PDGFRB、NG2在蛋白水平表达明显下降；抑癌基因Rb在蛋白水平呈现下降趋势，其余P16、P53、PTEN表达有所上调。
5．qPCRarray分析发现活化成纤维绌胞相对于未激活的成纤维绌胞，趋化因子CXCL8、CXCL5、CXCL2、CXCL1、CSF2、CSF3明显上调，其中CXCL5、CXCL8上调高达80多倍(P＜0.001)。
6．激活的成纤维细胞与PD-L1表达较低的三阴性乳腺癌绌胞(MDA-MB-468、Hs578t)其培养后，WB和qPCR检测蛋白和mRNA水平的PD-L1表达均上调，Siglec9在mRNA水平表达也上调；qPCR检测共培养后乳腺癌细胞CXCR2存mRNA水平表达有上调(p＜0.05)。
【结论】
体外共培养实验提示，在TNBC细胞可能通过产生可浴性细胞因子或趋化因子，使成纤维细胞巾的抑癌基因灭活，进而激活成纤维细胞成为癌相关成纤维细胞；反过来，活化成纤维绌胞又通过CXCL-X/CXCR2趋化因子信号通路促进癌细胞免疫抑制冈子PD-L1和IDO1的表达，使癌细胞产生免疫逃逸。但具体机制需要深入研究。