论文部分内容阅读
目的：近年来，组织工程骨已成为社会研究的热点，而成骨细胞和血管内皮细胞共培养是组织工程骨研究的首要条件。本实验将从共培养体系的建立入手，进而研究共培养体系对胰岛素生长因子1（insulin-like growthfactor-1,IGF-1）表达的影响及对血管内皮细胞生物学特性的影响。方法：本实验分为三部分，第一部分以成骨样肉瘤细胞株（Human osteosarcoma MG-63cell, MG63）及血管内皮细胞株（Vascularendothelial cells, VECs）为研究对象，细胞传代培养至第六代备用，通过5种不同的比例建立MG63-VECs共培养体系，通过倒置显微镜下细胞形态的观察来确定两种细胞的最佳共培养比例；第二部分，以第一部分的最佳共培养比例建立MG63-VECs共培养体系作为实验组，MG63及VECs单独培养作为对照组，分别在12h,24h,36h及48h提取各组上清液，利用ELISA实验方法对实验组和对照组各个时间点进行IGF-1表达值的检测；再利用Transwell小室将VECs及MG63按最佳比例进行间接共培养，实验分为4组，共培养A组，共培养B组，MG63组，VECs组，分别在12h,24h,36h及48h对各组进行RNA提取，再用荧光定量PCR检测IGF-1mRNA的表达。第三部分观察共培养体系对血管内皮细胞生物学特性的影响，一方面通过DIi染色示踪法观察，将VECs进行DIi染色，与MG63按1：1进行直接共培养为实验组，VECs进行DIi染色后单独培养为对照组，96h后在荧光显微镜下观察两组的管型情况；另一方面通过鼠尾胶原实验观察。利用鼠尾胶原制备三维培养环境，实验组为MG63与VECs按1：1进行直接共培养，对照组为VECs单独培养。72h后在倒置显微镜下观察管型的情况。以上原始实验数据均使用SPSS13.0软件分析，数据用均数±标准差（x±s）表示，两样本均数比较用独立样本t检验；多个样本两两比较先用方差分析（ANOVA），再用多样本两两比较中的SNK法进行比较，p<0.05及p<0.01表示差异有显著性和非常显著性意义。结果：第一部分，MG63培养至第五代在倒置显微镜下观察，细胞形态不规则，多为三角形及多角形。VECs呈圆形或椭圆形，呈铺路石样生长；直接共培养中MG63和VECs细胞按1:1培养时两种细胞生长最为良好，细胞间杂生长，其中血管内皮细胞呈结节样生长，成骨细胞生长于血管内皮细胞结节周围。第二部分，ELISA结果显示：共培养组IGF-1表达值较对照组明显增加(P<0.05)。荧光定量PCR结果显示：12h-48h共培养A组及MG63组IGF-1mRNA表达值随着时间呈上升趋势，共培养A组较MG63组IGF-1mRNA表达值明显增加(P<0.05)；共培养B组和VECs组IGF-1mRNA表达值随着时间出现不稳定变化趋势，在12h和36h呈上升趋势，24h和48h时呈下降趋势；共培养A组各时间点IGF-1mRNA表达值明显高于共培养B组养(P<0.01)。第三部分，体外管型实验，DIi示踪法96h荧光显微镜下观察实验组VECs出现类管型样结构，对照组VECs上层未见明显管型样结构形成。鼠尾胶实验72h倒置显微镜下观察，对照组形成类血管腔样结构；实验组少量细胞坏死，未见明显的血管腔样结构形成。结论：1、直接共培养中MG63和VECs按1:1培养时两种细胞生长最为良好，细胞间杂生长，其中VECs呈结节样生长，MG63生长于VECs结节周围。2、在MG63-VECs共培养体系中IGF-1的表达值优于二者的单独培养；间接共培养条件下共培养A组IGF-1mRNA表达明显高于共培养B组。3、通过共培养体系的管型实验证明在成骨细胞的参与下血管内皮细胞更易形成管型验证了在骨组织血管化中成骨细胞不仅仅构建了骨组织基本结构，还作为一种管型诱导功能细胞，参与了VECs的迁移和管型形成。