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研究背景和目的:
由于不同的地理环境和遗传的易感性,被认为与重症肌无力(myasthenia gravis,MG)发病密切相关的乙酰胆碱受体抗体(acetylcholine receptor antibody,AChR-Ab)和酪氨酸激酶抗体(muscle specific tyrosine kinase antibody,MuSK-Ab)的阳性率在各国报道不一。AChR-Ab阳性患者称为血清阳性重症肌无力(seropositive myasthenia gravis,SPMG),阴性的患者称为血清阴性重症肌无力(seronegative myasthenia gravis,SNMG)。国内现有的AChR-Ab和MuSK-Ab阳性率远远低于国外的报道,有一半左右的SNMG患者难以找到体液免疫的致病抗体。但均为小宗数据的统计结果。已证实MG的发病与细胞免疫的中枢器官胸腺密切相关。胸腺切除术是治疗重症肌无力的有效方法,但相当一部分MG术后出现反复的症状复发。我们对271例胸腺切除术后症状缓解的MG患者进行随访,发现135例术后出现了复发。复发现象可能与术后仍存在于外周的的致病免疫因子有关。在胸腺切除术后的MG,外周的自身免疫耐受主要由来源于胸腺定居于外周的调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)来维持。因此,胸腺和外周Tregs的数量与功能的改变是否与MG的复发有关?
另一方面,目前针对MG术后紊乱的免疫情况,临床尚缺乏既有效又能让患者耐受的药物。具有良好免疫调节功能的胸腺五肽(thymopentin 5,TP5)为解决MG术后复发提供了很好的思路。TP5已用于治疗多种自身免疫病,但用于调节MG紊乱的细胞免疫状况的报道罕见。本研究的研究目的:1.了解我国华南地区MG患者AChR-Ab、MuSK-Ab的阳性率,分析SNMG和SPMG发病特点,判断体液免疫在我国MG发病中的作用地位。2.通过观察MG病人胸腺及外周血CD4+CD25+Tregs的变化,探讨免疫耐受功能受损与MG术后复发的相关性。3.分析近6年临床随机对照使用TP5治疗MG的资料,判断TP5对MG的疗效。4.探讨胸腺生成素Ⅱ(Thymopoletin Ⅱ,TP Ⅱ)对MG患者的细胞免疫调节作用,为TP5的临床应用提供实验理论依据,以更好指导临床治疗。
材料与方法:
1.用放射免疫法检测2006-2007年门诊就诊的250例MG患者外周血清AChR-Ab,对其中66例AChR-Ab阴性者用放免法检测血清中的MuSK-Ab。并结合患者的临床资料,采用病例-对照研究的方法,分析SNMG及SPMG的发病特点。
2.流式细胞术分别检测儿童和成人MG外周血CD4+CD25+Tregs的数量及其表达的叉状头/翅膀状螺旋转录因子(forkhead/winged helix transcription factor,Foxp3)和细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4,CTLA-4)的情况。流式细胞术检测儿童MG及对照组的胸腺CD4+CD25+Tregs的数量。
3.采用前瞻性开放随机对照的研究方法,随机取胸腺切除术后的重症肌无力病人135例,成人62例,儿童73例,随机分为TP5治疗组及对照组,前者用TP5和免疫抑制剂治疗。对照组仅用免疫抑制剂治疗。随访1-5年不等,采用临床相对计分法作为疗效评定的标准观察各组治疗前后的变化。
4.用不同浓度的TP5刺激重症肌无力患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclears,PBMCs),使用ELISA的方法检测γ-干扰素(interferon-gamma,IFN-γ)的表达情况,从整体细胞水平观察TP5对细胞免疫效应因子的影响。同时使用流式细胞仪,在单个细胞水平上评价TP5对各亚群T淋巴细胞内细胞效应因子IFN-γ产生的影响。
研究结果:
1.250例MG患者AChR-Ab检出率为51.2%;66例的AChR-Ab阴性的MG患者中Musk-Ab检测率为0%。其中,眼肌型和全身型MG的AChR-Ab阳性率分别为46.0%、63.5%。眼肌型SNMG眼肌的症状较SPMG轻:绝大部分全身型SNMG的病情发展较快,临床症状并不比SPMG重,较少有延髓肌受累,少合并胸腺瘤,同时肌无力危象的发生率也较SPMG低。对全身型延髓肌受累及其可能影响因素进行了分析显示,AChR-Ab阳性是延髓肌受累的独立危险因素。另SPMG易并发其他一些全身症状。
2.与正常组比较,儿童MG患者的外周血CD4+CD25+Tregs的数量显著增高,但其转录表达因子Foxp3表达下降。无论儿童或成人MG患者的CD4+CD25+Tregs的表面分子CTLA-4.表达与正常组比较均无明显差异。
3.胸腺内CD25分子主要表达于CD4+单阳T细胞表面;儿童MG胸腺的CD4+CD25+Tregs数量较正常对照组显著增高。
4.TP5治疗胸腺切除术后MG的疗效:把年龄作为分层因素,各组缓解率有以下情况:与对照组比较,儿童治疗组2月-2年内的缓解率明显增高,成人治疗组于6月-2年有明显差异。同时,儿童患者用TP5后较对照组复发率减低,减、停药率增高。随访未发现不良反应。
5.TP5在体外能抑制CD4+和CD8+T细胞的效应细胞因子IFN-γ的表达。
结论:
1.我国华南地区AChR-Ab检出率较国外低;SNMG的发病率高,发病机制不明,与MuSK-Ab无关,其发病难以用体液免疫机制解释。无论眼肌型还是全身型的SNMG的病情均比SPMG轻,症状较局限,较少累及延髓肌,危象发生率低。
2.MG术后复发可能与相当一部分患者的外周免疫耐受功能受损有关,主要表现为CD4斗CD25+Tregs的功能的下降,尤见于儿童。这种功能缺陷可能与胸腺密切相关。MG外周与中枢免疫器官的免疫功能可能均受损。
3.TP5治疗重症肌无力,尤其MG患儿疗效肯定,能够减少复发次数,减轻复发程度,增加停、减药率。为根治MG提供了新的思路。
4.TP5可能主要通过抑制CD4+和CD8+T细胞的效应细胞因子的表达,以实现其对处于免疫紊乱状态MG的免疫调节,发挥治疗作用。