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猪圆环病毒分PCV1和PCV2两个血清型，其中，PCV1对猪没有致病性，PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的必须病原。该病毒有两个大的开放阅读框ORF1和ORF2，ORF1主要编码Rep蛋白，ORF2编码Cap蛋白，在这两个基因之间有1个复制原点(Ori)。嵌合病毒PCV1-2（PCV2 ORF2基因嵌合入PCV1）与野生型PCV2相比具有更低的致病力，显示PCV2 Ori和ORF1可能与PCV2致病作用有关，但Ori或Rep单个基因对PCV2致病力作用尚无报道。PCV2在猪群中仍广泛存在，PCV2疫苗在猪圆环病毒相关病（PCVAD）防控上发挥着重要作用，但其免疫抗体很难区分。此外，PCV2 Cap蛋白DNA疫苗虽然也有研究，但仍存在免疫剂量大和抗体产生迟缓等缺点。本研究以PCV2b为骨架，采用PCV1不同基因替代，构建并拯救了3个嵌合病毒，通过仔猪攻毒试验揭示PCV2 Rep基因为主要毒力基因;同时，采用TAT和Flag作为标签，分别构建了3个标记病毒;此外，通过人工合成3种穿膜肽MPG、ppTG20和TAT，分别与PCV2 DNA疫苗混合免疫小鼠，发现ppTG20对PCV2 DNA疫苗具有免疫增强作用，为PCV2新型疫苗研究奠定了基础。本研究具体内容如下: 1.猪圆环病毒2型与1型嵌合病毒的构建与致病作用 采用PCR扩增技术获得PCV1和PCV2的全长基因组，通过基因重组技术将PCV1和PCV2部分基因替换，构建了3个嵌合病毒全基因组，即PCV2b-Ori1（PCV2b为骨架嵌合PCV1的Ori基因）、PCV2b-rep1（PCV2b为骨架嵌合PCV1的Rep基因）和PCV2b-rep1-Ori1（PCV2b为骨架嵌合PCV1的Ori和Rep基因），同时，构建了PCV1和PCV2重组病毒全基因组作为对照。各环化基因组通过脂质体转染至PK-15细胞，IFA鉴定结果显示均检测到具有感染性的病毒粒子存在。连续5次传代后，重组病毒PCV2b-Ori1、PCV2b-Rep1和PCV2b-Rep1-Ori1均能稳定传代;PCV2b复制能力最高，第三代时病毒即达106.0TCID50/mL;PCV2-rep1与PCV1-rep1-Ori1复制能力相似，第3代病毒滴度达105.0TCID50/mL;PCV2-Oril复制能力最低，第5代滴度105.0TCID50/mL。病毒一步生长曲线结果显示，PCV2b和PCV1在体外具有相似的生长动力学特性，PCV2b-Ori1、PCV2b-rep1和PCV2b-rep1-Ori1嵌合体在36、48、60、72、84和96h滴度明显低于PCV2b。 选择4周龄PCV2和PRRSV阴性仔猪，用PCV2b、PCV2b-Ori1、PCV2b-rep1、和PCV2b-rep1-Ori1进行攻毒试验，同时设PBS阴性对照组。攻毒后第4、7天臀部和腋下肌肉注射钥匙孔血蓝蛋白2mg/头，以及腹腔注射10mL巯基乙酸培养基，另外每头仔猪在第11、19天腹腔注射10mL巯基乙酸培养基。在攻毒前进行称重，用于计算每头猪相对日增重，攻毒后每天观察临床症状;攻毒后0、7、11、19和29天采集血清，测定ELISA抗体，并用Real-time PCR测定血清病毒含量;攻毒后7、19和29天前腔静脉采血，分离PBMC，用ConA刺激72h后收集细胞上清，用定量ELISA检测IFN-γ，IL-10，TNF-α和IL-1β细胞因子;攻毒后第29天计算相对日增重，剖杀观察病理学变化，并取肺和腹股沟淋巴结进行组织病理变化观察，同时，取淋巴结提取病毒DNA，用Real-time PCR检测淋巴结中的病毒量。结果为:PCV2b-rep1-Ori1和PCV2b-rep1组临床症状、病毒血症、淋巴结病毒量、肺和淋巴结微观病理变化、PBMCs分泌IL-10和TNF-α量显著低于PCV2b感染组。PCV2b-Ori1和PCV2b组在肺和淋巴结微观病理变化、淋巴结病毒量、攻毒后29天病毒血症、PBMCs分泌TNF-α量上没有显著性差异。该研究结果表明，Rep基因可能在PCV2体内致病力上发挥重要作用。 2.猪圆环病毒2型标记重组病毒的构建与体外复制特性 采用基因重组技术将8个氨基酸Flag标签插入到PCV1-2b(PCV2b-rep1-Ori1)Cap蛋白C端，将11个氨基酸TAT标签插入到PCV2bCap蛋白C或N端，构建出三个重组基因组，即PCV1-2b-Flag、PCV2b-N-TAT和PCV2b-C-TAT。将环化基因组转染PK-15细胞，IFA检测结果均有感染性的病毒粒子。采用PCV2单克隆抗体Western blot鉴定，PCV2b-N-TAT、PCV2b-C-TAT和PCV1-2b-Flag均能像骨架病毒PCV2b和PCV1-2b一样与Cap蛋白单克隆抗体产生特异性结合;采用Flag单克隆抗体Western blot鉴定，PCV1-2b-Flag感染细胞有特异条带出现，大小正确，而PCV1-2b和PK-15细胞均未出现特异条带，证明Flag标签在标记病毒中得到了表达。在PK-15连续5次传代，PCV2b-N-TAT、PCV2b-C-TAT和PCV1-2b-Flag均能稳定传代，PCV2b-C-TAT复制能力大于PCV2b-N-TAT，小于PCV2b;PCV1-2b-Flag和PCV1-2b复制效率相似。PCV2b、PCV2b-N-TAT、PCV2b-C-TAT、PCV1-2b和PCV1-2b-Flag第5代滴度分别为106.16、104.12、105.25、105.16和104.91TCID50/mL。病毒一步生长曲线结果显示，PCV2b-C-TAT、PCV1-2b和PCV1-2b-Flag在体外具有相似的生长动力学特性，但PCV2b-N-TAT复制效率低于此3种病毒。PCV2b-N-TAT、PCV2b-C-TAT、PCV1-2b和PCV1-2b-Flag4种病毒复制效率均低于PCV2b病毒。标记病毒的构建为PCV2标记疫苗研究提供了重要材料。 3.穿膜肽ppTG20增强PCV2DNA疫苗小鼠免疫作用 为了提高PCV2DNA疫苗免疫效果，本研究合成MPG、ppTG20和TAT三种穿膜肽，分别和荧光蛋白质粒pEGFP-N及PCV2Cap蛋白真核表达质粒pVAX-SynCap(m)混合并转染体外培养细胞，结果显示，穿膜肽在低浓度时转染pEGFP-N能力较低，随着MPG、ppTG20和TAT浓度的升高，转染能力有了一定的提高，转染浓度256μg/mL时ppTG20和TAT转染组较MPG高。MPG、ppTG20和TAT分别与pVAX-SynCap(m)共同转化体外培养细胞，Western blot结果显示其均能将pVAX-SynCap(m)质粒转入细胞，其中，ppTG20转染效果最好。将MPG、ppTG20和TAT三种穿膜肽按50μg、100μg和200μg分别与100μgpVAX-SynCap(m)质粒混合后免疫小鼠，结果为:首免后9周，ppTG20200μg免疫组ELISA抗体和中和抗体显著高于pVAX-SynCap(m)单独免疫组。首免后6周和9周，ppTG20200μg免疫组淋巴细胞增殖应答显著高于pVAX-SynCap(m)单独免疫组。首免后9周，50～200μgppTG20、100～200μgTAT组IL-4水平显著高于pVAX-SynCap(m)单独免疫组;100～200μgppTG20和TAT200μg免疫组产生的IFN-γ细胞因子应答显著高于pVAX-SynCap(m)单独免疫组，表明ppTG20可以有效增强PCV2基因疫苗免疫效果，ppTG20穿膜肽可作为PCV2DNA疫苗的候选佐剂。