帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是仅次于阿尔茨海默病的第二大好发于老年人的中枢神经系统退行性疾病,也是最常见的运动障碍疾病。认知功能障碍是PD患者常见的非运动症状,随着中国人口的老龄化,PD及PD认知障碍已成为危害中国老年人群健康的主要疾病之一,给社会和家庭带来沉重的负担。PD轻度认知功能障碍(Mild cognitive impairment in Parkinson’s disease, PD-MCI)患者的认知功能损伤程度介于PD认知功能正常(Parkinson’s disease with cognitive normal, PDCN)和帕金森病痴呆(Parkinson’s disease dementia, PDD)之间。2012年1月国际运动障碍协会(The Movement Disorder Society, MDS)正式公布了PD-MCI的诊断标准,该诊断标准的提出明确了PD-MCI的存在和地位,对其进行研究将有助于我们更加全面深入地了解PD认知功能障碍的特点和其发展演变过程。目前PD及PD-MCI的病因仍不明确,可能与遗传、环境、衰老等因素相关,近年来神经免疫炎症机制在PD及PD-MCI发病中的作用受到普遍关注。趋化因子CC配基2 (chemokine CC motif ligand 2, CCL2;又称单核细胞趋化蛋白-1,monocyte chemoattractant protein, MCP-1),是一种重要的趋化因子,许多研究发现其在各种神经退行性病变中也发挥着重要的作用。在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)和HIV痴呆的研究中均发现其能加速认知功能的下降,导致痴呆形成,说明CCL2与认知功能障碍可能相关；而在对PD的研究中发现,PD患者血液、脑脊液的CCL2水平高于正常对照组,说明其与PD的发生发展可能也有某种程度的联系。但是目前还没有CCL2在PD认知障碍中作用的研究。血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)的破坏、小胶质细胞的增殖活化在PD及PD-MCI的病理过程中起着重要作用。而许有研究发现CCL2在血脑屏障的开放方面可能起到重要作用,AD中的研究则发现CCL2可以招募、增殖小胶质细胞,促进炎性因子、氧自由基产生,进而导致Ap异常聚集物形成、神经元死亡。PD-MCI尸检结果发现：以α-突触核蛋白(α-Synuclein, α-Syn)为主要成分的LB在边缘系统和大脑皮质不同程度地沉积,提示α-Syn异常聚集对PD-MCI的进展起重要作用。那么,CCL2在PD及PD-MCI中的作用是否也是通过破坏血脑屏障、促进小胶质细胞增殖活化、神经炎症发生,进而导致α-Syn异常聚集、多巴胺能神经元死亡呢?宾达利(Bindarit, BIND)是一种小的合成吲唑衍生物,能抑制CCL2的产生,具有有效的抗炎活性,在动物实验和最近的临床试验中均显示其在多种疾病中有抗炎治疗作用,机制主要通过抑制CCL2的产生。最近一项有关AD的研究显示其可以通过抑制CCL2的产生,减轻Aβ异常聚集物对神经元的毒性作用。目前尚无其在PD治疗中的作用报道。本文通过：(1)动物实验：慢性PD小鼠模型的制备,探索CCL2在其中的可能作用,是否破坏血脑屏障并促进脑内炎症产生,导致多巴胺能神经元死亡,并初步观察Bindarit的治疗作用；(2)细胞实验：研究CCL2是否促进α-Synuclein介导的小胶质细胞增殖,通过氧自由基、炎性因子产生,进而导致神经元凋亡；(3)通过临床病例研究验证CCL2与PD患者认知功能障碍的关系。从细胞水平、动物水平及临床研究3个层面,探讨CCL2在PD-MCI中的作用,为CCL2成为PD-MCI早期干预及早期防治的靶点研究,提供新的理论基础和依据。第一章CCL2在慢性小鼠帕金森病模型中血脑屏障的破坏及神经炎症中的作用研究目的：构建C57BL/6小鼠慢性帕金森病模型,观察小鼠认知功能状况；研究CCL2在PD血脑屏障破坏中的作用,以及Bindarit对血脑屏障的保护作用；并进一步研究CCL2在颅内小胶质细胞增殖、炎症反应及多巴胺能神经元变性丢失中的作用。方法：33只雄性8周龄C57BL/6随机分为3组,其中生理盐水Control组10只,MPTP/P模型组10只,Bindarit治疗组13只。MPTP/P模型组给予25mg/kg MPTP、 250mg/kg丙磺舒腹腔注射；Bindarit治疗组给予25mg/kg MPTP.250mg/kg丙磺舒、100mg/kgBindarit腹腔注射；生理盐水Control组给予等量生理盐水注射,每周注射2次,连续注射5周。(1)给药结束后行爬杆实验、旷场实验、水迷宫实验检测小鼠的运动功能及认知功能状况。(2)伊文思蓝实验观察各组小鼠血脑屏障破坏情况,western blot法检测各组小鼠血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达量,并进一步行透射电镜观察各组血脑屏障情况。(3)OX42免疫组化观察各组小鼠脑组织内小胶质细胞增殖活化情况。(4)TH免疫组化观察各组小鼠中脑黑质多巴胺能神经元变性丢失情况。(5) western blot法检测各组小鼠中脑α-Synuclein、凋亡相关蛋白caspase-3表达量。(6) TUNEL实验观察各组小鼠脑组织皮质神经元凋亡情况。(7)液相芯片法检测各组小鼠血清TNF-α、IL-1、 IL-17、IFN-γ、CCL2等炎性因子表达情况。结果：(1)爬杆实验结果显示MPTP/P模型组小鼠从杆顶下降到底部时间较Control组延长(P<0.05)；旷场实验结果显示与Control组相比,MPTP/P模型组小鼠运动距离减少、运动速度下降、中央区域活动时间减少(P<0.05)；水迷宫定位航行实验结果显示MPTP/P模型组小鼠的逃避潜伏期较Control组有明显延长(P<0.05)。(2)伊文思蓝实验结果显示MPTP/P模型组的伊文思蓝渗出量比Control组显著增多(P<0.05); Western blot结果显示MPTP/P组小鼠脑组织中血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达量较Control组减少(P<0.05),透射电镜结果显示MPTP/P模型组小鼠脑微血管内膜有断裂现象,血管周围渗出增多,紧密连接破坏。(3)OX42免疫组化结果显示MPTP/P模型组小鼠脑组织中OX42阳性表达的细胞数较Control组增加。(4)TH免疫组化结果显示MPTP/P模型组小鼠中脑黑质中TH阳性表达的细胞数较Control组减少(P<0.05)。(5)Western blot结果显示MPTP/P组小鼠脑组织中a-synuclein蛋白和caspase-3蛋白表达量较对照组增加(P<0.05)。(6) TUNEL实验结果显示MPTP/P模型组小鼠脑组织中神经元凋亡较Control组增加。(7)液相芯片结果显示MPTP/P模型组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-17、IFN-γ、CCL2含量高于对照组(P<0.05)；而Bindarit治疗组则上述现象均有所改善。结论：(1)C57BL/6小鼠腹腔注射MPTP、丙磺舒,每周注射2次,连续注射5周,可以制作稳定的慢性PD模型,且部分小鼠存在认知功能障碍。(2)CCL2在慢性PD小鼠模型中可能起到破坏血脑屏障,促进脑内小胶质细胞增殖活化、炎症产生,进而导致多巴胺能神经元死亡的作用。(3) Bindarit在慢性PD小鼠模型中可能起到一定的治疗作用。第二章CCL2促进α-Synuclein介导的小胶质细胞增殖活化及神经元凋亡目的：通过原代小胶质细胞、原代神经元培养,探索CCL2是否促进a-Synuclein(a-Syn)介导的小胶质细胞增殖活化,导致氧自由基、炎性因子产生,进而导致神经元凋亡增加。方法：原代培养的小胶质细胞分离纯化后分为6组：分组方法①0ng/ml组、12.5ng/ml组、25ng/ml组、50ng/ml组、1OOng/ml组、200ng/ml组,分别给予相应剂量的CCL2处理；分组方法②Control组、CCL2组、a-Syn组、CCL2+α-Syn组、CCL2+α-Syn+CCL2 Ab组、CCL2+α-Syn+BIND组,其中CCL2组：50ng/mlCCL2; α-Syn组：200ng/mlα-Syn; CCL2+α-Syn组：50ng/mlCCL2+200ng/mlα-Syn; CCL2+α-Syn+CCL2 Ab组：50ng/mlCCL2+200ng/mlα-Syn+5ug/mlCCL2 Ab;CCL2+α-Syn+BIND组：50ng/mlCCL2+200ng/mlα-Syn+50nMBindarit。处理24小时后：(1)CCK8法、Brdu法检测各组小胶质细胞增殖活化情况；(2) Griess试剂检测各组小胶质细胞培养液中NO含量；(3) ELISA法检测各组小胶质细胞培养液中TNF-α、IL-1β含量；(4)免疫荧光检测各组小胶质细胞α-Syn表达情况；(5)原代神经元培养,加入各组小胶质细胞培养液,流式细胞法检测其对神经元凋亡的作用。结果：(1)CCK8法、Brdu法检测各剂量CCL2组小胶质细胞增殖活化情况,结果显示50ng/ml组小胶质细胞增殖活化最为明显,其次为100ng/ml组,这两组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；第二种分组方法中CCL2+α-Syn组小胶质细胞增殖活化最为明显,其次为CCL2组,这两组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),而CCL2+α-Syn+CCL2 Ab组和CCL2+α-Syn+BIND组增殖活化细胞相对减少。(2) Griess试剂检测各剂量CCL2组小胶质细胞培养液中NO含量,结果显示显示50ng/ml组小胶质细胞产生NO含量最多,其次为100ng/ml组,这两组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；第二种分组方法中CCL2+α-Syn组小胶质细胞产生NO量最多,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),加入CCL2 Ab或者Bindarit后,小胶质细胞产生NO含量相对减少。(3) ELISA法检测各剂量CCL2组小胶质细胞培养液中TNF-α及IL-1β含量,结果显示各组与对照组相比差异没有统计学意义(P>0.05)；第二种分组方法中CCL2+α-Syn组小胶质细胞产生TNF-α及IL-1p含量最多,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),加入CCL2 Ab或者Bindarit后,小胶质细胞产生TNF-α及IL-1p含量相对减少。(4)免疫荧光法检测各组小胶质细胞α-Syn表达情况。结果显示CCL2+α-Syn组小胶质细胞α-Syn表达最多,加入CCL2 Ab或者Bindarit组,小胶质细胞α-Syn表达减少。(5)流式检测原代培养的神经元各组凋亡情况,结果显示加入CCL2+α-Syn组培养液的神经元凋亡比率最高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),加入CCL2Ab或者Bindari组,神经元凋亡相对减少。结论：CCL2能促进α-Syn介导的小胶质细胞增殖活化,导致NO等氧自由基、炎性因子如TNF-α及IL-1β等产生增加,进而引起神经元凋亡增加。第三章CCL2基因多态性及其血浆、脑脊液水平与帕金森病认知功能障碍关系研究目的：(1)探讨广东省汉族人群中CCL2启动子区2518A/G(rs1064211)及其受体趋化因子受体2(CCR2)V64I(rs1799864)基因多态性与PD及PD认知功能障碍的相关性。(2)对PD及PD-MCI患者的血浆、脑脊液CCL2水平进行检测,探讨血浆、脑脊液CCL2水平与PD、PD-MCI的关系。方法：(1)收集521例PD患者及556例正常对照者全血,采用连接酶检测反应(LDR)法检测两组患者CCL2 2518A/G (rs1064211)及CCR2 V64I (rs1799864)基因多态性。其中217例PD患者采用简易认知功能评估量表(MMSE)、蒙特利尔评估量表(MOCA)、成人韦氏认知功能评估量表(WAIS-RC)、成人韦氏记忆力评估量表(WMS-RC)评估其认知功能。运用RXC卡方检验比较两组基因型分布频率的差异,方差分析比较PD患者各基因型认知障碍的差异,分析其与PD及PD认知功能障碍的相关性。(2)收集140例PD患者和70例正常对照者血浆,45例PD患者和16例正常对照者脑脊液,再将PD组分为PDCN组和PD-MCI组；采用ELISA法检测血浆、脑脊液中CCL2水平,比较PDCN组、PD-MCI组和对照组血浆、脑脊液CCL2浓度水平。结果：(1)PD组及正常对照组CCL2及CCR2等位基因和基因型频率之间不存在差异(P>0.05)。同时,PD患者中CCL2及CCR2各基因型之间未发现认知障碍差异(P>0.05)。(2)PDCN组和PD-MCI组的血浆CCL2浓度明显高于正常对照组,且PD-MCI组更高(P<0.05)。PD-MCI组的脑脊液CCL2浓度相对正常对照组及PDCN组明显增高(P<0.05)。结论：(1)在广东汉族人群中CCL2-2518A/G (rs1064211)及CCR2 V64I(rs1799864)基因多态性与PD及PD认知障碍可能无相关性。(2)PD患者血浆CCL2水平高于正常对照组,并且PD-MCI组尤为显著。(3) PD-MCI组的脑脊液CCL2浓度高于正常对照组及PDCN组。