柑橘褐斑病菌过氧化物酶体对接复合体蛋白AaPex13和AaPex14生物学功能研究

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柑橘褐斑病是由互隔链格孢菌橘致病型(Tangerine pathotype of Alternaria alternata)引起的危害性极大的柑橘病害,会造成落叶、落果、枯枝,导致果园产量大幅下降,给柑橘产业带来巨大损失。由非必需染色体基因编码合成的ACT毒素(Alternaria citri toxin)是病菌的关键致病因子。过氧化物酶体是真核细胞中普遍存在的一种单层膜细胞器,自身并无DNA,其基质蛋白由细胞核基因编码于细胞质中合成。基质蛋白依据自身包含的靶向信号肽被特定受体识别后,通过与过氧化物酶体膜上的对接复合体互作转运至到过氧化物酶体中。Pex13和Pex14是过氧化物酶体对接复合体中的两个核心蛋白,在稻瘟病菌(Magnaporthe Oryzae)和禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)中Pex13和Pex14对过氧化物酶体的形成、菌体生长发育、次级代谢物的合成以及致病至关重要。然而,对Pex13和Pex14是否与柑橘褐斑病菌ACT毒素合成相关,乃至过氧化物酶体在互隔链格孢菌中的功能知之甚少。在本研究中,我们通过比较突变体ΔAaPex13和ΔAaPex14和回补菌株及野生型菌株Z7的表型变化,对AaPex13和AaPex14的生物学功能进行探究。我们的研究发现:(1)与野生型菌株Z7相比,ΔAaPex13和ΔAaPex14突变体中带有PTS1或PTS2信号肽的基质蛋白都不能正确定位到过氧化物酶体上;(2)ΔAaPex13和ΔAaPex14突变体的菌丝中几乎不形成过氧化物酶体,但脂质体的数量与野生型相比无显著差异;(3)与野生型菌株Z7相比,ΔAaPex13和ΔAaPex14突变体在PDA培养基上菌落生长速度无明显变化,但产生的气生菌丝的量分别减少了68.3%和48.8%,菌丝的黑色素积累量分别减少了77.5%和61.5%,基因回补后可恢复其营养生长能力;(4)AaPex13和AaPex14基因的缺失会影响柑橘褐斑病菌的分生孢子形成,在PDA培养基上培养14天后发现,ΔAaPex13和ΔAaPex14突变体的产孢量分别减少了91.4%和87.5%,孢子萌发率分别减少了79.4%和86.9%;(5)柑橘褐斑病菌ΔAaPex13和ΔAaPex14突变体的对氧化胁迫剂的敏感性增强;(6)ΔAaPex13和ΔAaPex14突变体对细胞壁胁迫剂的敏感性增强,且突变体的细胞壁变薄;(7)通过孢子悬浮液和菌饼接种测定致病力发现,ΔAaPex13和ΔAaPex14突变体丧失对红橘叶片的致病力,回补菌株致病力基本恢复到野生型菌株水平。此外,ΔAaPex13和ΔAaPex14突变体产生的致病性决定关键因子ACT毒素的量分别降低了30%和33%。以上结果说明,在柑橘褐斑病菌中,AaPex13和AaPex14基因与过氧化物酶体基质蛋白定位和过氧化物酶体的形成相关,影响病菌的生长发育、环境胁迫应答、ACT毒素生物合成以及致病性。这些结果为进一步解析柑橘褐斑病菌的致病分子机制奠定基础,同时也将为柑橘褐斑病的防治提供一定的理论依据。
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