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第一部分肉豆蔻酰甘氨酸修饰的S1PR3特异性激动肽跨膜激活效应研究研究目的:拟通过合成 1-磷酸鞘氨醇受体 3(Sphingosine 1-phosphate Receptor 3,S1PR3)特异性激动肽并经肉豆蔻酰甘氨酸(Myristoyl-glycine)修饰,研究并检测该肽对巨噬细胞THP-1细胞“S1PR3-MAPKs”通路的跨膜激活效应。研究方法:设计合成源自七次跨膜受体S1PR3胞内第2个环的短肽,并经Myristoyl-glycine 修饰,命名为 GPS-725.017。Western blot 检测 GPS-725.017 对巨 噬细胞(THP-1)MAPKs通路关键分子细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)及应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase,JNK)磷酸化水平的影响。组内或组间不同浓度和不同时间点蛋白灰度值比较采用多因素方差分析。研究结果:与溶剂对照组相比,30 μmol/L或50μmol/L的GPS-725.017处理THP-1细胞10min,p-ERK 水平显著升高(30μmol/L,3.10±0.27vs.7.98士0.45,P<0.001;50μmol/L,4.78±0.44 vs.25.98±2.32,P<0.001);50 μmol/L 的 GPS-725.017 处理 THP-1细胞5 min、10 min、20 min和30 min,与溶剂组相比,各时间点p-ERK或p-JNK水平均显著上升(均为p<0.01)。研究结论:源于S1PR3胞内第二个环经肉豆蔻酰甘氨酸修饰而成的特异性激动肽GPS-725.017可显著活化巨噬细胞“S1PR3-MAPKs”通路。第二部分S1PR3特异性激动肽在脓毒症治疗中的应用研究研究目的:第一部分研究结果表明,GPS-725.017可激活THP-1细胞的S1PR3-MAPK信号转导途径,介导细胞功能活化。我们拟进一步研究GPS-725.017对E.coli感染的小鼠巨噬细胞激活效应,观察巨噬细胞细菌清除功能的变化。并予GPS-725.017处理盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)脓毒症小鼠,观察其对脓毒症预后的影响。研究方法:1.采用庆大霉素保护实验观察E.coli被吞噬后的清除率。分离小鼠腹腔巨噬细胞,实验组为10 μmol/L的GPS-725.017预处理30min,对照组为溶剂PBS预处理相同时间。2.通过在体应用GPS-725.017于盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)小鼠脓毒症模型,观察其对脓毒症预后的影响。使用SPSS 16.0软件或Prism 6.0进行统计学分析,结果采用均数±标准差(mean±SD)表示。多组比较采用多因素方差分析及Bonferroni post-test,以p<0.05为差异有统计学意义。研究结果:1.比较10 μmol/L浓度GPS-725.017处理腹腔巨噬细胞后,杀菌功能的变化。相较溶剂对照组,实验组在3h和6h杀菌能力明显增强(p<0.01)。2.建模及治疗后10天,统计两组脓毒症小鼠的生存率,GPS-725.017治疗组脓毒症小鼠(n=30)生存率显著高于对照组(n=27),差异具有统计学意义(p<0.05)。研究结论:1.体外实验发现,S1PR3特异性激动肽GPS-725.017可以增强巨噬细胞的杀菌作用。2.在体实验发现,GPS-725.017能明显提高脓毒症小鼠生存率。