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基因重排是流感病毒大流行毒株产生的主要方式。猪由于对禽流感和人流感病毒均易感,一直被认为是流感病毒的混合器。目前,H1N1/2009病毒和欧洲类禽(Eurasian Avian-like,EA)H1N1猪流感病毒在猪群中共同流行,具备发生基因重排产生新病毒的条件。H1N1/2009病毒在人群中具有高度传播性,而人群中又缺乏针对EA H1N1猪流感病毒的HA的抗体,这两利-病毒一旦结合,很有可能产生出潜在的大流行病毒,因此需要评价其重排病毒的潜在危害。但由于对猪流感病毒的监测缺乏系统性,我们难以评价这两种病毒产生的重排病毒的潜在危害性。因此,本论文拟以猪为动物模型,将两种病毒同时感染猪,模拟两种·病毒的自然重排方式,通过系统分析这些重排病毒的基因型以及对哺乳动物的致病性和传播性,对重排病毒的潜在危害进行预测,为将来流感大流行的防控提供理论依据。通过将H1N1/2009病毒和EA H1N1猪流感病毒以相同的剂量感染猪,分别从猪的上下呼吸道进行病毒分离。通过蚀斑纯化和全基因测序,我们从300个克隆中分离到了55株重排病毒,重排病毒的分离率为18%。序列分析表明,这些重排病毒共分为17个基因型,其中携带EAHA的重排病毒有33株,占据重排病毒总数的60%,包含10个基因型；携带HIN1/2009HA的重排病毒为22株,占据重排病毒总数的40%,包含7个基因型。在所有基因型组合中,携带H1N1/2009病毒RNP基因的重排病毒占据主导地位。猪上呼吸道重排病毒的分离率为8%(19/240),分离到的重排病毒大部分携带H1N1/2009的HA基因,占据重排病毒的84%(16/19)。猪下呼吸道重排病毒的分离率为60%(36/60),与上呼吸道分离的重排病毒相反,其中大部分重排病毒携带EA H1N1的HA基因,其占据78%(28/36)。这些结果说明猪的下呼吸道更容易产生重排病毒,携带不同HA基因的重排病毒具有不同的上下呼吸道偏好性。为了探究这些重排病毒的致病性和传播性,本研究以小鼠和豚鼠为动物模型,探究了17种重排病毒对小鼠的致病性和对豚鼠的传播性。结果发现,所有重排病毒均对小鼠易感,并且发现6种重排病毒显著增强了对小鼠的致病性。其中13种重排病毒都可以在豚鼠间进行传播,有5种病毒表现出高效传播能力。同时发现,这些具有高效传播力的病毒也呈现出对小鼠高毒力表型。进一步比照病毒基因序列分析发现,这些病毒具有相似的基因组合特征：都含有EA病毒的HA或者NS基因,同时也含有H1N1/2009的RNP基因。为了进一步解析EA病毒HA和NS基因增强重排流感病毒致病力的机制,本研究通过分析受体结合特性、聚合酶活性以及IFN-β mRNA的表达水平,探究了EA病毒的HA和NS基因对重排病毒致病性的影响。结果发现EA病毒的HA基因使重排病毒获得了禽类样受体结合特性,从而提高了流感病毒在小鼠中的毒力作用,并进一步证明了EA病毒的HA基因G222E是影响这一分子机制的关键位点。同时还发现EA病毒的NS基因提高了病毒的RNP聚合酶活性进而影响病毒的致病性。之前研究发现D222G通过改变受体结合特性提高了H1N1/2009病毒对小鼠的毒力。而目前的报道还发现H1N1/2009HA蛋白的222位存在氨基酸变异多态性,其中D222N的突变在H1N1/2009感染的重症病例中出现频率较高。这一氨基酸位点处于HA蛋白的受体结合区,D222N变异是否影响H1N1/2009病毒的致病性尚不清楚。通过反向遗传技术,我们构建了H1N1/2009大流行病毒及D222N的突变病毒,探究了这些病毒在体外细胞系(MDCK/A549)上的生长动力学,受体结合特性以及对BALB/c小鼠的致病性。结果发现,D222N病毒在MDCK细胞上表现出较高的复制能力,而在A549细胞上恰好相反。D222N的变异提高了流感病毒对α,2-3受体的结合特性,却表现出对小鼠较弱的致病力。由此推测D222N位点的改变可能与H1N1/2009重症病例之间并无关联。综上所述,EA H1N1猪流感病毒和H1N1/2009病毒可以在猪体内产生重排病毒,这些重排病毒的类型受上下呼吸道偏好性以及聚合酶活性的影响。同时,携带EA病毒的HA、NS基因和H1N1/2009病毒的RNP基因的重排病毒不仅是优势基因病毒,而且还表现出对哺乳动物的高毒力和高效传播力。本研究结果不仅为临床上新型重排病毒的出现进行了有效预测,并为潜在大流行毒株的防控提供了重要的理论依据。