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细菌生长主要以浮游和贴附两种形式进行。细菌贴附于实体表面后一方面进行分裂增殖,另一方面分泌胞外多糖基质,将细菌包裹于基质内,形成细菌生物膜。由于胞外基质的物理和电荷屏障以及内部特殊的生态环境,细菌生物膜所致感染较浮游细菌更难防治,是包括慢性骨髓炎在内的多种慢性感染性疾病的主要病因之一。一旦细菌生物膜在骨缺损周围骨组织、死骨、内固定或人工关节表面滋生,将导致反复发作的慢性骨髓炎,给患者带来极大的痛苦。PMMA、Osteoset T在局部缓释抗生素,提高了骨髓炎的治愈率,但PMMA需二次手术取出,同时研究表明单纯清创与清创后植入Osteoset T在骨髓炎的治愈率方面无明显差异。此外,高浓度庆大霉素可抑制人成骨细胞和内皮细胞的增殖,从而影响骨折愈合。慢性感染性骨缺损实际上是一种合并骨缺损的慢性骨髓炎,其主要病因仍是细菌生物膜的形成。脂质体是磷脂分散在水中定向排列而形成的囊泡,可包封抗生素,按表面电荷不同分为阳离子、阴离子和中性脂质体。研究表明,阳离子脂质体青霉素对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)生物膜的抑制作用显著强于青霉素,其机制与S.aureus生物膜带负电荷有关;另一方面,脂质体可使包封药物在骨髓浓聚,因此静脉注射脂质体抗生素可增强骨感染灶局部抗生素浓度,进而消除感染。同时,脂质体可降低高浓度抗生素对成骨细胞、内皮细胞的毒性作用。然而人体网状内皮系统对血液中的脂质体具有很强的清除作用,大大降低了脂质体抗生素的半衰期,削弱其抗感染能力。由于抗生素缓释系统可在感染灶释放高浓度抗生素,因此,将脂质体抗生素负载于载体在理论上可解决这一问题。但脂质体抗生素负载于载体后再释放的抗细菌生物膜作用是否受到影响尚不明确。本研究首先制备阳离子脂质体庆大霉素,将其负载于同种异体骨和硫酸钙,分别进行释放实验,并探讨释放的阳离子脂质体庆大霉素对S.aureus ATCC 29213生物膜生长的抑制作用,然后构建兔慢性感染性骨缺损模型,了解S.aureus ATCC 29213注射剂量对该模型的影响,并行阳离子脂质体抗菌骨对兔慢性感染性骨缺损的治疗作用。此外,研究还探讨了脂质体抗生素静脉注射对兔慢性感染性骨缺损的治疗作用。本课题包括四部分:1、S.aureus注射剂量对兔慢性感染性骨缺损形成的影响。2、脂质体庆大霉素静脉注射对兔慢性感染性骨缺损的治疗作用。3、阳离子脂质体抗菌骨的制备以及体外对S.aureus生物膜生长的抑制作用。4、阳离子脂质体抗菌骨对兔慢性感染性骨缺损的治疗作用。第一部分S.aureus注射剂量对兔慢性感染性骨缺损形成的影响实验方法1构建兔慢性感染性骨缺损模型,制备骨缺损,微量注射器先后注入S.aureusATCC 29213,注射总量分别为6×101-6×106CFU。2术后3w处死所有实验兔。计算体重变化,评估肉眼观察评分及兔放射学改变。将兔左下肢胫骨取出进行细菌学检查,测量并计算平均每克标本中的细菌数。主要实验结果注射剂量达6×105CFU即可使所有实验兔在肉眼观察评分、放射学检查及细菌学检查呈现出明显感染征象。第二部分脂质体庆大霉素静脉注射治疗兔慢性感染性骨缺损的实验研究实验方法1不同脂质体庆大霉素的制备三种原材料(阳、阴离子脂质体)或两种(中性脂质体)按照一定比例混合,旋转蒸干制成脂质膜,加入庆大霉素溶液,振荡制成脂质悬液,超声处理后离心去除上清中尚未包被的庆大霉素,沉淀以ddH2O重悬制成庆大霉素脂质体。2兔慢性感染性骨缺损模型的制备兔麻醉后消毒铺巾,切开皮肤,暴露胫骨近端骨面,制造骨缺损,骨蜡封闭,先后注入精氨酸和S.aureus ATCC 29213,缝合皮肤。造模术后行大体观察,X线检查,X线检查提示慢性骨髓炎后开始治疗实验。3脂质体庆大霉素静脉注射治疗兔慢性感染性骨缺损造模成功后分组进行不同脂质体庆大霉素静脉注射治疗,治疗3w后处死实验动物。处死前抽血、X检查,处死后取左下肢近端胫骨骨髓行细菌学检查。主要实验结果:对照组血细菌培养和骨细菌培养均为阳性;阳离子脂质体庆大霉素治疗组血培养均为阴性,骨培养4只阴性;阴离子脂质体庆大霉素组和单独庆大霉素治疗组血培养呈阴性,但骨培养均为阳性;中性脂质体庆大霉素治疗组血培养阴性,骨培养2只阴性;第三部分阳离子脂质体抗菌骨的制备及体外对葡萄球菌生物膜的抑制作用实验方法1阳离子脂质体抗菌骨的制备阳离子脂质体庆大霉素的制备与第二部分相同。无菌取兔胫骨及股骨干骺端,经脱脂、脱蛋白、脱钙后制得兔同种异体骨。将上述同种异体骨块及硫酸钙浸泡至阳离子脂质体庆大霉素溶液中,蒸干,60Co辐照消毒。2阳离子脂质体抗菌骨的体外释放实验将阳离子脂质体庆大霉素抗菌骨置于微孔板,加入ddH2O,室温振荡。于振荡后不同时间更换ddH2O,并将所更换出的液体以Triton X-100进行处理,测定庆大霉素浓度。3阳离子脂质体抗菌骨体外对葡萄球菌生物膜的抑制作用培养S.aureus ATCC 29213生物膜。分别取释放实验中8个不同时相点释放的阳离子脂质体庆大霉素溶液,并以上述8个时相点的释放浓度配制新鲜阳离子脂质体庆大霉素、庆大霉素,将各组抗生素分别加入S.aureus ATCC29213生物膜,1h后弃去上清,加入培养基,并于此后每隔30min检测每孔溶液在630nm的吸光度。计算细菌生长速率,并得出最大细菌生长速率及所需时间。主要实验结果:阳离子脂质体庆大霉素抗菌骨在释放前期具有爆发释放效应,且在释放前期的特殊时间段所释放的庆大霉素总百分比与(时间)1/2成线性关系(R2>0.9)。由阳离子脂质体庆大霉素抗菌骨中释放的阳离子脂质体庆大霉素对S.aureus ATCC 29213生物膜生长的抑制作用与新配制的同浓度阳离子脂质体庆大霉素无显著差异(P>0.05),二者在低浓度时对S.aureus ATCC 29213生物膜生长的抑制作用显著强于单独使用庆大霉素(P<0.01)。此外,庆大霉素对S.aureus ATCC 29213的MIC为230.4 mg/L。第四部分阳离子脂质体抗菌骨对兔慢性感染性骨缺损的治疗作用实验方法1阳离子脂质体抗菌骨及兔慢性感染性骨缺损模型的制备与第三部分相同。2实验兔分组,进行静脉注射、手术清创植入抗菌骨治疗。2w后行X线检查,抽静脉血行血液培养,处死后取局部骨髓组织行细菌学检查。主要实验结果:对照组没有抗生素治疗,均出现明显感染,血液及骨髓培养均呈S.aureus阳性。单独手术植入同种异体骨或硫酸钙组评分较A组更高,但差异不显著(P>0.05)。单独使用庆大霉素治疗2w可使兔血液培养阴性,且感染评分低于对照组,二者相差显著(P<0.05),且全部骨髓培养均阳性。使用阳离子脂质体庆大霉素静脉注射治疗可有效清除血液感染,评分低于A、B、H、I组,且与上述4组相差显著(P<0.05),同时评分高于F、G组,相差显著(P<0.05),治疗的6只兔中有2只骨髓培养阴性。采用庆大霉素同种异体骨和庆大霉素硫酸钙治疗效果相似,低于F、G组(P<0.05),治疗的6只兔中有3只骨髓培养阴性。两种阳离子脂质体抗菌骨疗效相似,可完全清除血液、骨髓感染,感染评分低于上述各组,且相差显著(P<0.05)。主要结论1、耐药S.aureus可诱导明显的胫骨感染性骨缺损形成,6×105 CFU/5ul的剂量不仅可使慢性骨髓炎模型制备成功率达100%,而且能够出现较明显的放射学和细菌学改变。2、脂质体庆大霉素可有效治疗慢性感染性骨缺损,其中以阳离子脂质体庆大霉素效果最为明显,中性次之,阴离子脂质体庆大霉素与单独使用庆大霉素相同,但任何一种脂质体庆大霉素均不能完全清除感染。3、低温真空负压吸引法制备阳离子脂质体庆大霉素抗菌骨并不影响所释放的阳离子脂质体庆大霉素对S.aureus生物膜的抑制作用,且在低浓度对S.aureus生物膜抑制显著强于单独使用庆大霉素。4、手术清创后植入阳离子脂质体庆大霉素抗菌骨对兔胫骨S.aureus慢性感染性骨缺损的治疗效果优于庆大霉素抗菌骨以及静脉输注阳离子庆大霉素、庆大霉素。