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目的本实验通过高糖培养血视网膜外屏障的主要细胞即视网膜色素上皮(RPE)细胞,建立糖尿病大鼠模型,并用SIRT1激动剂白藜芦醇和慢病毒PGC-1αsh RNA转染技术进行干预,检测RPE细胞中SIRT1、PGC-1α、ROS、线粒体膜电位、细胞凋亡情况和观察糖尿病大鼠视网膜中SIRT1、PGC-1α的表达及视网膜细胞的凋亡情况,探究SIRT1是否通过调控PGC-1α的表达参与血-视网膜外屏障RPE细胞和糖尿病大鼠视网膜的氧化损伤,推测其是否参与DR的发生发展,为DR的早期预防和治疗提供新的理论依据。方法1.不同时间高糖培养对RPE细胞中SIRT1、PGC-1α表达的影响取细胞生长状态良好6代以内的RPE细胞,分为5组,高糖(4.5g/L)刺激不同时间,分别为A(NG)、B(12h)、C(24h)、D(48h)、E(72h),Real Time-q PCR检测SIRT1m RNA和PGC-1αm RNA的表达量变化情况。2.白藜芦醇和慢病毒PGC-1αsh RNA对高糖培养的RPE细胞氧化损伤的影响取生长状态良好6代以内的RPE细胞,分为6组同步化干预72h:NG(正常对照组)、HG(高糖组4.5g/L)、HG+R(高糖4.5g/L+白藜芦醇50μmol/L组)、HG+P(高糖4.5g/L+慢病毒PGC-1αsh RNA组)、HG+R+P(高糖4.5g/L+白藜芦醇50μmol/L+慢病毒PGC-1αsh RNA组)、HG+EV(高糖4.5g/L+空载病毒组),采用免疫组织化学检测各组大鼠视网膜中SIRT1蛋白的表达情况,提取各组细胞总RNA,应用Real-Time PCR检测SIRT1m RNA和PGC-1αm RNA的含量,应用流式细胞仪检测线粒体膜电位、ROS含量及细胞凋亡(AnnexinⅤ-FITC/PI法)情况。3.白藜芦醇和慢病毒PGC-1αsh RNA对糖尿病大鼠视网膜氧化损伤的影响将SD大鼠随机分为6组,每组8只。具体实验分组:NC(正常对照组)、DM(糖尿病组)、DM+EV(糖尿病+空载病毒组)、DM+R(糖尿病+白藜芦醇组)、DM+P(糖尿病+慢病毒PGC-1αsh RNA组)、DM+R+P(糖尿病+白藜芦醇+慢病毒PGC-1αsh RNA组)。大鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin STZ 55mg/kg)建造糖尿病模型,建模成功后,DM+R和DM+R+P组给予白藜芦醇50mg/kg·d灌胃,每日一次,其余组予等量溶剂(羟甲基纤维素)灌胃,DM+P和DM+R+P组给予玻璃体腔注射慢病毒PGC-1αsh RNA,DM+E组予玻璃体腔注射空载病毒,干预8周后取材,采用免疫组织化学检测各组大鼠视网膜中SIRT1和PGC-1α蛋白的表达情况,提取各组视网膜总RNA,应用Real-Time PCR检测SIRT1和PGC-1αm RNA的含量,TUNEL法检测各组视网膜细胞的凋亡情况。结果1.不同时间高糖培养对RPE细胞中SIRT1、PGC-1α表达的影响Real-Time PCR结果显示:SIRT1、PGC-1α在正常RPE细胞中有表达,高糖培养呈时间依赖性引起SIRT1 m RNA表达降低(P<0.05),12h即明显下降,48h达到最低;同样PGC-1αm RNA的降低在高糖刺激12h即明显下降(P<0.05),随高糖刺激时间延长表达逐渐下降,在72h下降最为明显。2.白藜芦醇和慢病毒PGC-1αsh RNA对高糖培养的RPE细胞氧化损伤的影响(1)免疫组化及Real-Time PCR结果显示:HG组与NG组相比SIRT1和PGC-1α的表达明显下降(P<0.05),与HG+EV组相比无明显差异(P>0.05);HG+R组与HG组相比,SIRT1和PGC-1α的表达有所增高(P<0.05);HG+P组SIRT1的表达与HG组相比无明显差异(P>0.05),PGC-1α的表达与HG组相比进一步下降(P<0.05);与HG+R组相比,HG+R+P组SIRT1的表达无明显差异(P>0.05),PGC-1α的表达明显下降(P<0.05)。(2)流式细胞术检测ROS含量结果显示:HG组ROS的含量明显高于NG组(P<0.05),与HG+EV组相比无明显差异(P>0.05);HG+R组ROS含量低于HG组(P<0.05);HG+P组ROS含量高于HG组(P<0.05);HG+R+P组ROS含量高于HG+R组(P<0.05)。(3)线粒体膜电位检测结果显示:HG组线粒体膜电位明显低于NG组(P<0.05),与HG+EV组相比无明显差异(P>0.05);HG+R组线粒体膜电位高于HG组(P<0.05);HG+P组线粒体膜电位低于HG组(P<0.05);HG+R+P组线粒体膜电位低于HG+R组(P<0.05)。(4)AnnexinⅤ-FITC/PI法检测细胞凋亡情况结果显示:HG组细胞凋亡率明显高于NG组(P<0.05),与HG+EV组相比无明显差异(P>0.05);HG+R组细胞凋亡率低于HG组(P<0.05);HG+P组细胞凋亡率高于HG组(P<0.05);HG+R+P组细胞凋亡率高于HG+R组(P<0.05)。3.白藜芦醇和慢病毒PGC-1αsh RNA对糖尿病大鼠视网膜氧化损伤的影响(1)免疫组化及Real-Time PCR结果显示:正常视网膜中有SIRT1和PGC-1α的表达。DM组与NC组相比SIRT1和PGC-1α的表达明显下降(P<0.05),与DM+E组相比无明显差异(P>0.05);DM+R组与HG组相比,SIRT1和PGC-1α的表达有所增加(P<0.05);DM+P组与DM组相比,SIRT1表达无明显差异(P>0.05),PGC-1α表达下降明显,与DM组相比进一步下降(P<0.05);DM+R+P组SIRT1的表达与DM+R组相比无明显差异(P>0.05),PGC-1α的表达下降明显,下降程度明显高于DM+R组(P<0.05)。(2)TUNEL法检测细胞凋亡情况结果显示:DM组中细胞凋亡率明显高于NC组(P<0.05),与DM+E组相比无明显差异(P>0.05);DM+R组细胞凋亡率低于DM组(P<0.05);DM+P组细胞凋亡率高于DM组(P<0.05);DM+R+P组细胞凋亡率高于DM+R组(P<0.05)。结论1.不同时间高糖培养RPE细胞中的SIRT1m RNA和PGC-1αm RNA表达下降,且呈时间依赖性。2.高糖培养72h的RPE细胞中ROS含量增多,线粒体膜电位下降,凋亡率升高,提示线粒体功能障碍参与了高糖导致的RPE细胞氧化损伤。3.白藜芦醇可活化SIRT1,上调高糖培养的RPE细胞和糖尿病大鼠视网膜中SIRT1、PGC-1α的表达。4.慢病毒PGC-1αsh RNA可以有效的干扰高糖培养的RPE细胞和糖尿病大鼠视网膜中PGC-1α的合成,抑制其表达。5.活化SIRT1,可以改善高糖培养的RPE细胞和和糖尿病大鼠视网膜组织的氧化损伤,降低细胞凋亡率,该作用被慢病毒PGC-1αsh RNA所抑制,提示SIRT1通过调控PGC-1α的表达参与高糖培养的RPE细胞和糖尿病大鼠视网膜的氧化损伤。