论文部分内容阅读
研究背景：卵巢癌是妇科常见肿瘤,也是女性恶性肿瘤主要的死亡原因。由于早期卵巢癌无明显临床表现,大多数患者在诊断时已经处于晚期腹腔转移阶段。晚期卵巢癌患者腹腔中大量难治性腹水的出现,不仅加剧了患者的痛苦,也为卵巢癌细胞产生耐药和发生转移提供了必备的存活环境,由此决定了卵巢癌的不良预后。多细胞球体(Multicellular Spheroids, MCS)是卵巢癌细胞在腹水中的一种主要存在方式,越来越多的研究认为MCS的形成是卵巢癌细胞脱落后在腹水中存活的必要形式,是卵巢癌细胞成功发生转移的必要条件。所以,构建卵巢癌细胞的悬浮MCS模型对于研究晚期卵巢癌腹水中的肿瘤细胞特性,尤其是其对化疗药物的耐受性,具有重要的临床意义。作为肿瘤细胞非锚定依赖性生长的一种重要方式,悬浮MCS的生存和功能很大程度上依赖于细胞间粘附分子的作用。E-cadherin作为一种细胞间粘附分子,一度被认为是肿瘤抑制蛋白。近年研究发现,E-cadherin的作用并非如此简单。在乳腺癌中,E-cadherin表达下降或缺失预示着肿瘤细胞的恶性程度较高、预后较差,但E-cadherin表达也是乳腺癌细胞悬浮MCS中细胞粘附和聚集的必要条件。但需要注意的是,E-cadherin在卵巢癌中的作用与其他肿瘤存在很大差别。E-cadherin在卵巢癌细胞中的表达显著高于正常卵巢上皮细胞,并能通过介导细胞粘附激活卵巢癌细胞内的PI3K/AKT及MEK/ERK等信号通路促进卵巢癌细胞的生长和增殖,这高度提示E-cadherin在卵巢癌细胞悬浮MCS中可能发挥独特而重要的作用。但是,E-cadherin在卵巢癌细胞中的作用及机制仍存在很大争议。目的：卵巢癌是妇科恶性肿瘤的主要死因,而晚期卵巢癌患者腹水中存在的多细胞球体(Multicellular Spheroids, MCS)是转移卵巢癌细胞的主要存在方式。E-cadherin作为一种重要的细胞粘附分子,我们推测在MCS的形成和存活中发挥重要作用。因此我们建立高表达E-cadherin卵巢癌细胞的立体悬浮培养模型,并对其生长增殖行为和对化疗药物的耐药性进行初步研究。方法：1.通过多聚2-羟乙基甲基丙烯酸脂(2-hydroxylethyl methacrylate, Poly-HEMA)凝胶阻止细胞贴壁,对E-cadherin表达水平各异的三株卵巢癌细胞进行立体悬浮培养,观察、比较其悬浮生长的过程、特点及差别；2.通过钙离子剥夺实验证明E-cadherin在卵巢癌悬浮MCS中的作用；3.通过CCK8细胞增殖实验检测MCS生长增殖特点；4.通过CCK8细胞增殖实验检测MCS对化疗药物顺铂的敏感性。结果：1.成功构建了高表达E-cadherin的SKOV-3卵巢癌细胞立体悬浮生长MCS模型。与低表达E-cadherin的OVCAR-3和不表达E-cadherin的SKOV-3形成的悬浮细胞团相比,高表达E-cadherin的卵巢癌细胞形成的MCS体积大、细胞连接紧密度高、维持时间长。2.MCS在钙离子螯合剂EDTA的作用下逐渐分解,最后变为单个细胞或仅含几个细胞的微小细胞团块；对照组的悬浮MCS用胰酶消化,MCS裂解程度远差于EDTA作用的效果,仍呈大细胞团状。3.高表达E-cadherin的SKOV-3卵巢癌细胞悬浮MCS (MCS of SKOV-3with high expression of E-cadherin, SK-H-M)、不表达E-cadherin的SKOV-3卵巢癌细胞悬浮MCS (MCS of SKOV-3with no expression of E-cadherin, SK-N-M)和低表达E-cadherin的OVCAR-3卵巢癌细胞MCS(MCS of OVCAR-3with low expression of E-cadherin, O V-L-M)在24、48、72h三个时间点的细胞增殖活性无显著差异(P>0.05)；同一时间点,SK-H-M与SK-N-M和OV-L-M的细胞增殖活性亦无显著差异(P>0.05)。4.加入顺铂72h后,三种卵巢癌细胞悬浮MCS均显著低于相应贴壁细胞的死亡率(P<0.05)；顺铂作用72h后,SK-H-M的死亡率显著低于SK-N-M和OV-L-M的死亡率(P<0.05)；顺铂作用72h后的SK-H-A的死亡率显著低于SK-N-A和OV-L-A的死亡率(P<0.05)。结论：1.成功构建了模拟卵巢癌细胞转移的悬浮MCS模型(SK-H-M)。2. E-cadherin促进卵巢癌细胞悬浮MCS的形成和维持。3.卵巢癌细胞悬浮MCS处于增殖静止状态。4.卵巢癌细胞悬浮MCS的耐药性与E-cadherin表达水平呈正相关,有可能是晚期卵巢癌治疗的重要干预靶点。