钙调蛋白磷酸酶催化亚基羧基端调节区域及免疫抑制剂对其活性的抑制研究

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本文为了研究催化亚基(CNA)调节片段对钙调蛋白磷酸酶(Calcineurin,简称CN)和免疫抑制剂相互作用的影响,表达纯化了本实验现有的CNA及其3个剪切突变体CNAabc(1-456),CNAab(1-388),CNAa(1-347),结果发现:随着调节区段的剪切,酶的Km值逐渐增大,Vmax也逐渐增大;此外,如果比较四种酶的基础活力可以发现,酶的基础活性在以DNPP和RII为底物时都有明显增加,CNa的基础活性要比CNA的高出数百倍。然后进一步比较免疫抑制剂一亲免蛋白对它们的抑制,结果发现: BBH为必需,缺失了该区的突变体CNAa不再受抑制;CBD对于免疫抑制剂一亲免蛋白的抑制无影响;AID则会减弱免疫抑制剂一亲免蛋白的抑制作用。 通过CaM融合表达后酶切的方法表达纯化了CNA的C末段系列剪切片段:Ci511(389—511),Ci482(389—482),Ci456(389—456),Ci413(389—413),并合成了AID(457—482)片段。通过比较这些片段对于CNAab与CNAa的抑制作用,结果表明:除经典的AID区域外,CBD区域对酶活也存在自抑制作用;Ci413的抑制与BBH(347—388)相关而AID的抑制则不需要BBH的存在;以RII为底物时对CNAab,Ci413为典型的非竞争性抑制而AID为典型的竞争型抑制。 综上所述,BBH区域对外源抑制剂的作用和内源调节片段的抑制都是必需的,除了经典的AID区域外,CBD区域对酶活也有抑制作用,而且以RII为底物时对CNA388,Ci413为典型的非竞争性抑制而AID为典型的竞争型抑制。
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