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LRRC4是一个脑组织相对特异性表达基因,是采用表达序列标签(EST)介导的定位、候选克隆策略结合5’-RACE技术从染色体7q31～32区域克隆出来的一个富亮氨酸重复(LRR)超家族的新成员。LRRC4是神经系统发育与轴突生长的功能基因,其表达与胶质瘤的级别进展呈负相关,LRRC4的表达缺失参与脑胶质瘤进展的晚期事件。LRRC4能够下调一系列神经生长因子或受体(如IGF,EGF,PDGF,CNTF,bFGF,GDNF和BDNF等)的表达,通过调控多种信号转导通路(K-Ras/c-Raf/ERK/MAPK,PI-3K/AKT/NF-κB,p70S6/PKC,STAT3以及JNK2/c-Jun/mp53等)将U251细胞阻滞在G1晚期,抑制脑胶质瘤细胞的增殖和侵袭,而且这种抑制作用依赖于它的LRR结构域。
本研究应用荧光差异凝胶电泳(DIGE)和质谱(MALDI-TOF-MS)分析技术比较LRRC4基因转染脑胶质瘤U251细胞前后的差异表达蛋白质谱,阐明LRRC4对脑胶质瘤U251细胞蛋白质表达谱的影响,进一步揭示LRRC4抑瘤的分子机制。通过DIGE分析,以差异表达大于2倍为标准筛选差异蛋白质点14个,经质谱鉴定出11个蛋白质,其中上调蛋白质为5个:Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)；Rho GDPdissociation inhibitor alpha(ARHGDIA)；heat shock protein27(HSP27)；translationally-controlled1(TPT1)；Chain A,SolutionStructure Of Recombinant Human Brain-Type Fatty Acid BindingProtein。下调蛋白质为6个:haymaker protein；acetyl-Coenzyme Aacetyltransferase2(ACAT2)；Chain A,Endoplasmic Reticulum ProteinRp19 O95881(ERP19)；stathmin1；Chain A,Human Platelet ProfilinComplexed With An L-Pro10-iodotyrosine Peptide；S100 calciumbinding protein A11(S100A11)。这些差异蛋白质涉及细胞代谢、增殖、翻译、信号转导等众多事件,表明LRRC4基因转染U251细胞后可能通过调控这些蛋白质的表达而参与增殖、黏附、趋化和侵袭等生物学过程。
LRRC4调控的差异蛋白质的验证
1、Western Blot方法的验证结果
通过Western blot验证了ACAT2,ARHGDIA,ERP19,HSP27,Stathmin1,TPT1,S100A11等7个蛋白质在LRRC4基因转染U251细胞前后的表达变化。发现,ACAT2,ERP19、Stathmin1、S100A11在LRRC4基因转染U251细胞后表达下调,ARHGDIA,HSP27,TPT1在LRRC4基因转染U251细胞后表达上调,与DIGE和质谱鉴定结果一致。
2、免疫组织化学方法的验证结果
为了进一步证实上述实验结果,本研究选择了stathmin1和S100A11两个与细胞增殖相关的基因产物,采用免疫组织化学的方法检测了它们在不同临床分级的星形胶质瘤活检组织中的表达情况,发现,Stathmin1和S100A11随着星形胶质瘤级别的增加而表达升高,提示stathmin1和S100A11可能是星形胶质瘤恶性进展的重要分子标志。