论文部分内容阅读
生物大分子(包括蛋白质、核酸和病毒等)对生物体的生命活动起着十分重要的作用,这是由它们具有特殊的空间结构所致。随着生物学领域对精确的生物大分子结构需求的日益增加,尤其是利用单晶X射线衍射法得到的三维结构,使得研究生物大分子晶体的生长越来越受到重视。然而,生物大分子的结晶相当困难,从某种意义上讲这是生物大分子结构测定的限速因素。目前对生物大分子的晶体生长机理、成核的过程、基本的热力学和动力学参数等的认识很少,所以在晶体的缺陷、分子在晶格中的定向力和分子间键连作用以及溶液中传质过程方面的认识也很有限。因此,进行的生物大分子晶体生长的研究就显得非常必要。目前已有一些技术应用于研究生物大分子晶体的生长机理中,如光散射技术(QELS)和原子力显微镜(AFM)等,而迄今为止,AFM仍为进行这一研究的非常重要的工具。
本论文通过AFM实验主要进行了部分蛋白质晶体的生长过程的研究,包括杜仲抗真菌蛋白(Eucommiaantifungalprotein,简称EAFP)、天花粉蛋白(Trichosanthin,简称TCS)、天麻抗真菌蛋白(Gastrodiaelataantifungalprotein,简称GAFP),并取得了一定进展,有一些新的发现:
1.EAFP在其水溶液中能形成一种环状聚集体,在40mg/ml的高浓度时其直径大小从100nm到300nm左右,而在低浓度(5mg/m/l)时只有10-25nm左右,且数量较少。有的形成一个完整的环,有的环正在形成。这说明EAFP分子间本身有着较强的相互作用,能自发地在水溶液中进行聚集,且随溶液的浓度变小而聚集能力降低。
2.EAFP晶体的生长速度很快,通常只需要数小时就可长到较大尺寸(约1mm),要比普通的蛋白质晶体生长快很多倍,而且沿着晶体学轴向的生长速率也各不相同,表现出明显的各向异性;且生长的速率还与蛋白质溶液的过饱和度密切相关,过饱和度较高时(大于1.78)生长极为快速,难以进行速率的测量;当过饱和度为1.45时,EAFP晶体的{100}面上的生长速率b方向上平均为12nm/s,c方向上平均为24.2nm/s;当过饱和度为1.15时,其生长速率b方向上为4.1nm/s;c方向上为8.8nm/s,而此时,其生长速率仍与报道的其他蛋白质晶体生长速率基本相当,这些都说明EAFP晶体具有很快的生长速率。
3.实时原位AFM研究EAFP单斜晶体{100}面的生长过程结果表明EAFP晶体生长并非以单一的生长模式进行,而是随生长条件的变化采取不同的生长特征,有以下因素可能与EAFP的晶体快速生长机制相关:①多重不对称二维岛堆垛生长源;②活泼的不对称螺旋错位生长源(主要以不对称的双左旋为主,以不断出现的多个无规的右旋为次);③台阶按编组生长的动态特性。
4.EAFP在低过饱和度下的螺旋生长过程中会出现台阶的合并,从而表现出单-双的螺旋台阶,在小范围扫描中捕获到了这种现象,使得对螺旋生长台阶的合并过程有了更加深入的认识;并且台阶的生长受到沿晶体学b轴方向上的21螺旋对称的控制;当台阶生长至第八到第九层时,螺旋台阶会自动地形成完整的生长层,这充分说明了EAFP分子或分子簇具有良好的自身调节能力,这样在晶体生长过程中,晶体的缺陷减少,晶体质量提高,这也可说明EAFP晶体的x射线衍射能力很强的原因。
5.通过对EAFP晶体中各种相互作用分析表明:一个EAFP分子与周围的相邻分子间有218个残基间的相互作用,其中有18个是强的相互作用,有72个较强作用(间距小于4埃),这些作用大部分与晶体学c方向上的作用相关,说明在c方向上作用较强。由于这种差别,使得EAFP在结晶过程中,当分子受到不同方向上的作用力时,便形成了表面形貌的不对称,进而影响到晶体的外貌。另外,通过大分子结构分析XPLOR(NIH版)对EAFP在溶液中和在晶格中的分子能量的较为详尽的分析表明,尽管两种状态下的EAFP分子骨架差别不大(主要是侧链Arg残基伸展方向不同),但晶格中的EAFP分子采用较为有利的构象,使结晶过程能够顺利进行;且沿结晶学不同方向上分子间的相互作用能(尤其是氢键能的差别)也不同,沿c方向上要比沿b方向上强约1/3,这也与AFM结果分析相一致。
6.发现天花粉晶体所有表面上没有螺旋位错或台阶生长,只在其{001}面上发现明显的非对称线性的3D核进行生长。这些线性聚体均沿着晶体学〈110〉的方向进行排列,而且相互平行,这可说明天花粉分子间在这个方向上有着较强的相互作用,使得分子沿着这个方向容易进行聚集;对于GAFP晶体,原位实时动态的原子力显微成像初步的研究发现在其晶体的{001}表面晶体生长较为缓慢,没有发现台阶和螺旋位错生长现象,而是以分子聚集体的形式,慢慢从溶液中沉积到晶体表面,初步确定为法向生长(normalgrowth)。
由于蛋白质分子本身和蛋白质晶体生长体系的复杂性,本文的工作仅针对所研究对象进行讨论,进一步更深入的研究尚在进行中。