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深静脉血栓（Deep venous thrombosis,DVT）是血液在静脉内不正常地凝结,使血管完全或不完全阻塞,多发生于下肢。血栓脱落随循环血流阻塞肺动脉或其分支导致肺循环和呼吸功能障碍,引起肺动脉栓塞。DVT具有高发病率、高死亡率和高漏诊率的特点,致命性肺栓塞是骨科大手术后非预期死亡的主要原因之一。D-二聚体是临床判断血液高凝状态、评估血栓形成风险的常用指标,但特异性差。Virchow三联征:即内皮损伤、高凝状态、血流瘀滞是血栓形成的基本条件,但是DVT发生发展的病因和病理机制不完全清楚。研究发现DVT常随着人体年龄增长而逐渐高发,认为血管内皮细胞衰老,抗凝和纤溶活性下降,是DVT发生发展的重要因素,因此我们试图研究与血管内皮生长发育相关的衰老机制,进而找到有效的靶点进行分子治疗。长链非编码RNA（lncRNAs）具有作为转录活性分子、调控其它RNA或者蛋白的表达、染色质的修饰、指导核糖核蛋白复合物定位以及作为蛋白或RNA组装的平台等功能,在肿瘤、心血管疾病、血液病、炎症以及衰老等相关的疾病中发挥重要作用。长链非编码RNA（lncRNAs）根据在基因组上的位置,可分为正义lncRNA、反义lncRNA、基因间lncRNA、基因内lncRNA和双向lncRNA这5种主要类型。其中,反义lncRNA（Antisense lncRNA）因其结构特殊而备受关注,它们主要通过转录抑制、RNA-DNA相互作用（染色质重塑）、RNA-RNA相互作用及RNA-蛋白相互作用,在表观修饰、转录水平和转录后水平调控正义转录物的表达。有研究表明,沉默75%随机挑选的反义长链非编码RNA,均导致了邻近蛋白编码基因的表达下降,因此,反义长链非编码RNA能够调节邻近蛋白编码基因的稳定与转录,精密控制这些发育多样性基因位点的时空表达,并参与到与之相关的发育和其它生物学过程。研究表明Sirt1在脉管系统广泛分布,它通过调控内皮细胞衰老、炎症、氧化应激及与血小板的粘附,抑制动脉血栓、动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤、糖尿病周围血管病变等疾病的发展。因此,血管内皮细胞可能是Sirt1作用于疾病的重要靶点。然而,关于Sirt1在深静脉血栓中的变化及作用还未见报道。基于以上背景,本研究选择内皮衰老这DVT发生发展中的关键因素,从临床、细胞、动物水平来研究lncRNASirt1-AS在DVT中的作用及可能的机制,力求揭示lncRNASirt1-AS通过对内皮细胞的调控,参与DVT的发生发展。[目 的]探讨lncRNA Sirt1-AS通过靶向Sirt1,调控内皮细胞衰老,影响DVT形成的作用及分子机制。[方 法]1.RT-PCR检测DVT患者血液样本lncRNA Sirt1-AS和Sirt1 mRNA的表达量。2.RT-PCR,Western Blot检测相关DVT模型小鼠血液中lncRNA Sirt1-AS和Sirt1,细胞衰老相关标志物（p16、p21、p53）以及血栓形成相关标志物（P-Selectin、PSGL-1和vWF）的mRNA及蛋白的表达量,同时测量血栓的重量和长度并对血栓进行HE染色3.RNA-RNA pulldown,FISH荧光检测Sirt1是否为lncRNASirt1-AS的靶基因。CCK-8,β-半乳糖苷酶染色检测脐静脉内皮细胞活力,核糖核酸酶保护测定和放线菌素D测定检测Sirt1与lncRNASirt1-AS的稳定性。RT-PCR,Western Blot检测人类脐静脉内皮细胞中当lncRNASirt1-AS过表达同时伴或不伴Sirt1抑制时Sirt1和lncRNA Sirt1-AS,细胞衰老标志物,血栓形成相关标志物,FOXO3a的mRNA及蛋白的表达量。[结 果]1.临床水平:DVT患者静脉血液中lncRNA Sirt1-AS和Sirt1 mRNA的表达明显降低,即lncRNASirt1-AS和Sirt1的表达量与DVT的严重程度成负相关。2.动物水平:狭窄法构建早衰小鼠DVT动物模型,用白藜芦醇激活Sirt1后,Sirt1和lncRNASirt1-AS表达上调,细胞衰老相关标志物（p16、p21、p53）的表达下调,血栓长度和湿重减少,血栓形成相关标志物（P-Selectin、PSGL-1和vWF）的表达下调。而通过si-Sirt1或EX527抑制Sirt1后,上述作用被逆转。LncRNASirt1-AS过表达后,Sirt1表达上调,细胞衰老相关标志物（p16、p21、p53）的表达下调,血栓长度和湿重减少,血栓形成相关标志物（P-Selectin、PSGL-1和vWF）的表达下调。而通过shRNA转染抑制Sirt1-AS后,上述作用被逆转。3.细胞水平:在人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）中,通过RNA-RNA pull-down及荧光原位杂交等实验证实了 Sirt1是lncRNASirt1-AS的靶基因。同时,年轻的细胞与衰老的细胞相比,Sirt1和lncRNA Sirt1-AS表达高,而细胞衰老标志物（p16、p21、p53）降低。当 lncRNASirt1-AS 过表达时,Sirt1 和 lncRNASirt1-AS表达明显增加,细胞衰老标志物（p16、p21、p53）表达则降低,同时IL-8、MCP-1、IL-1α,IL-6、MMP-3、MMP-9、P-selectin、PSGL-1 和 vWF 的表达下调,但抑制Sirt1后,lncRNA Sirt1-AS的上述作用显著减轻。此外,lncRNA Sirt1-AS过表达后,FOXO3a的蛋白表达明显下调,而lncRNA Sirt1-AS与Sirt1抑制后,这种作用被逆转。Western Blot蛋白检测也获得了一致结果。最后,通过免疫共沉淀验证了 Sirt1与FOXO3a的相互作用。[结 论]DVT的发生发展与内皮细胞衰老和Sirt1的低表达有关。过表达LncRNA Sirt1-AS通过上调Sirt1表达,促进FOXO3a降解,抑制内皮衰老,减少DVT形成。