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在真核细胞中,RNA聚合酶Ⅱ(RNA Pol Ⅱ)负责大多数编码蛋白质的mRNA和核内小RNA(snRNA)基因的转录,其碳端结构域(CTD)为RNA聚合酶Ⅱ所特有,在结合转录循环和基因表达中扮演着重要的角色,转录循环过程中,TFIIH和P-TEFb是参与其磷酸化修饰调控的重要通用转录因子。其中,P-TEFb不仅是一种通用转录因子,同时也是艾滋病毒(HIV-1)转录复制过程中不可或缺的宿主转录因子之一。P-TEFb对CTD磷酸化模式的分析一直是研究热点。然而,CTD高度磷酸化状态及其七肽重复结构(YSPTSPS)等特性使其质谱分析面临巨大挑战。本课题首先建立P-TEFb磷酸化RNA聚合酶Ⅱ CTD的体外实验模型,基于生物质谱技术对磷酸化模式进行分析。主要内容包括以下几点:(1)建立高活性P-TEFb的亲和分离制备方法,运用合成肽段底物对激酶活性进行验证;(2)通过胰酶酶切成功鉴定CTD片段第1位至第18位及第228位至第388位氨基酸片段,共9个肽段,对没有酶切位点的第19位至第227位氨基酸片段进行微波辅助酸水解方法对CTD进行化学方法剪切,共鉴定53个肽段,发现CTD片段酸水解的断裂位点具有Y、P、K及R选择性,对两部分肽段样品分别进行质谱分析,CTD蛋白覆盖率达到92%;(3)在体外激酶反应开始后,选取10、30、120及240分钟等时间点,运用上述方法对CTD的磷酸化状态进行跟踪分析,发现P-TEFb偏好于磷酸化CTD的七肽重复结构的第五位丝氨酸残基,当磷酸化反应进行足够长时间时,第七位丝氨酸残基也被磷酸化,第二位丝氨酸残基可以发生低程度的磷酸化,第50个七肽重复序列以后的31个氨基酸残基几乎没有被P-TEFb磷酸化。总之,本课题通过构建基于液质联用的检测方法研究P-TEFb高度磷酸化RNA聚合酶Ⅱ CTD过程,为揭示CTD发生磷酸化的位置、频率及P-TEFb对CTD不同氨基酸的特异性等问题提供了直观且精确的方法。