臂丛根性撕脱伤会引起运动神经元的大量死亡,前期的研究表明运动神经元的凋亡涉及一系列分子事件。撕脱伤后m RNA芯片筛查发现促神经元存活和轴突再生的基因表达下降,而与凋亡和DNA损伤相关的基因表达上升;但是调控这些基因变化的分子机制、以及这些变化的基因在运动神经元凋亡进程中的作用并未完全明了。微小RNA(micro RNA)是一类非编码RNA,通过翻译后抑制靶蛋白的表达水平而发挥作用。目前越来越多的研究证明:在脊髓损伤后mi RNAs的表达发生了变化。但是对于臂丛撕脱伤和运动神经元凋亡进程中mi RNAs表达变化的研究十分有限,本课题组长期开展臂丛根性撕脱伤的基础研究,发现撕脱伤后凋亡和再生基因表达变化具有时间特异性,损伤后3天内检测凋亡和再生基因均显著异常,而损伤后14天则以凋亡相关基因和过氧化反应异常为主,结合撕脱伤导致运动神经元的显著凋亡也从损伤后14d开始,本研究选择撕脱伤后3和14天的节点,研究损伤脊髓内在mi RNA的生物学特性,以期揭示mi RNAs在撕脱伤中的作用和机制。一、臂丛根性撕脱伤引起成年大鼠脊髓mi RNAs表达谱变化规律目的:筛选成年大鼠臂丛撕脱伤引起的脊髓内在差异表达的mi RNAs方法:建立臂丛撕脱伤模型,分别损伤后3天和14天进行mi RNAs基因芯片检验,随后采用PCR实时定量分析的方法验证芯片筛选出来的差异表达mi RNAs,利用生物信息学软件对差异表达的mi RNAs进行靶基因预测分析并对靶基因在撕脱伤中表达的时空特征进行验证。结果:(1)应用mi RNAs表达谱芯片发现总共有3361个mi RNAs在成年大鼠的脊髓中表达,脊髓中表达量最高的前10个mi RNAs有mi R-124-3p,mi R-9a-3p,mi R-34a-5p,mi R-9a-5p,mi R-125b-5p,mi R-let-7c-5p,mi R-29a-3p,mi R-23b-3p,mi R-451-5p,and mi R-30c-5p;(2)对比撕脱伤后3天和14天后脊髓对照侧和损伤侧mi RNAs的表达情况,撕脱伤引起10个mi RNAs表达持续升高,有4个mi RNAs在损伤后3天表达升高,14天表达降低,只有mi R-466c-3p在损伤后表达持续下降。在损伤后3天,有40个mi RNAs表达上升,有23个mi RNAs表达下降,这些mi RNAs在损伤后14天恢复到正常表达水平。在损伤后14天,有25个mi RNAs表达上升,有18个mi RNAs表达下降,对比损伤后14天和3天的损伤侧,5个mi RNAs表达上升,5个mi RNAs表达下降。(3)荧光实时定量逆转录PCR(quantitative real-time reverse transcription PCR,q RT-PCR)对其中6个差异表达的mi RNAs进行了验证:包括在损伤后14天表达上升的mi R-146-5p和mi R-31a-3p;在损伤后3天和14天表达持续下降的mi R-466c-3p;以及对比损伤后14天比损伤后3天表达上升的mi R-144-3p和表达下降的mi R-137-3p,mi R-376b-3p。结果显示:RT-q PCR与mi RNAs基因芯片的结果相符合。(4)靶基因预测结果显示:在撕脱伤后3天表达下降的mi R-324-5p和mi R-484的靶基因预测是转录激活因子-3(activating transcription factor 3;ATF-3)和c-jun;而撕脱伤14天表达下降的mi R-137-3p和mi R-335的靶基因分别预测为中性蛋白酶-2(calcium-activated neutral protease-2,Calpain-2)和胶质纤维胶质蛋白(glial fibrillary acidic protein;GFAP)。免疫荧光检测发现撕脱伤脊髓运动神经元内,ATF-3蛋白和c-jun蛋白的表达水平在撕脱伤3天后上升,calpain-2蛋白和GFAP蛋白的表达水平在撕脱伤14天上升。值得注意的是撕脱伤后14天,除了生物学分析表明表达下降的mi R-137-3p和表达上升的calpain-2蛋白呈靶向调控的关系,同时calpain-2阳性细胞也表达在脊髓前角神经元胞浆中,提示我们mi R-137-3p与calpain-2的靶向关系可能与神经元的凋亡密切相关。小结:mi RNA基因芯片、q RT-PCR,以及靶基因免疫荧光实验结果揭示了成熟大鼠脊髓组织mi RNAs在臂丛根性撕脱伤中表达变化的时间特异性,表明差异表达的mi RNAs参与了撕脱伤脊髓的病理过程,提示mi R-137-3p通过调控靶基因Capn2调控运动神经元凋亡的进程。二、mi R-137-3p调控Capn2蛋白表达水平的靶基因验证实验目的:在分化的PC12细胞上验证Capn2是mi R-137-3p的靶基因方法:体外培养分化的PC12细胞,转染GFP标记的过表达mi R-137-3p慢病毒,倒置荧光显微镜检测慢病毒的转染效率,CCK-8检测转染慢病毒的细胞活力,确定转染慢病毒的最佳MOI值为100后,设立正常PC12细胞、转染mi R-137-3p慢病毒PC12细胞实验组、以及转染空载病毒PC12细胞对照组,分别处理分化的PC12细胞,荧光定量PCR检测mi R-137-3p和calpain-2 m RNA的水平,Western-blot检测calpain-2和n NOS蛋白的水平。免疫荧光细胞化学检测calpain-2和n NOS蛋白在正常PC12细胞的表达特征。同时设立正常PC12细胞组,转染calpain-2 si RNA组,转染random-sequence RNA对照组,分别处理分化的PC12细胞,荧光定量PCR和Western-blot分别检测calpain-2和n NOS的m RNA和蛋白水平。结果:(1)转染36小时和60小时后,可检测到GFP标记的慢病毒转染的分化PC12细胞,转染细胞胞体饱满,胞浆丰富,突起清晰可见,绿色荧光均匀分布于胞体和突起内。其中MOI值为100和100+polybrene的荧光强度和阳性细胞数目明显高于MOI值为50和50+polybrene,最终确定慢病毒转染PC12细胞的最佳MOI值为100+polybrene。(2)CCK-8检测结果细胞活力,以正常PC12细胞组表达量作为100%,mi R-137-3p慢病毒组以及空载病毒组相对表达量分别为99.66%和99.83%,表明慢病毒对分化的PC12细胞无毒性作用。(3)荧光定量PCR结果显示,将正常PC12组设为1,各实验组mi R-137-3p m RNA的相对表达量:mi R-137-3p慢病毒组为757.51±73.23,空载病毒组为1.20±0.22,表明慢病毒转染mi R-137-3p基因成功;Calpain-2 m RNA的相对表达量:mi R-137-3p慢病毒组为0.28±0.09,空载病毒组为1.23±0.32,两组之间的差异有统计学意义(P<0.05),表明上调mi R-137-3p可以抑制Calpain-2 m RNA的表达水平。(4)Western结果显示将正常PC12组设为1,mi R-137-3p慢病毒组calpain-2/GAPDH比值仅为0.51±0.07,而空载病毒组calpain-2/GAPDH比值为1.03±0.12;两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。我们同时检测了n NOS蛋白的水平,将正常PC12组设为1,发现mi R-137-3p慢病毒组n NOS/GAPDH比值仅为0.53±0.03,而空载病毒组n NOS/GAPDH比值为1.14±0.15,两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)双荧光素酶实验结果表明,与单独转染p MIR-REPORT-calpain-2-wt载体、单独转染p MIR-REPORT-calpain-2-mut载体、或者共转染mi R-137-3p的mimic与p MIR-REPORT-calpain-2-mut载体的三组比较,共转染mi R-137-3p mimic与p MIR-REPORT-calpain-2-wt载体组中,相对荧光素酶表达值明显降低(P<0.05)。表明Capn2是mi R-137-3p的靶基因。(6)转染Calpain-2的si RNA和random-sequence si RNA后,在荧光显微镜下未见细胞明显死亡,行荧光定量PCR和western-blot检测calpain-2 m RNA和蛋白水平,将正常PC12组设为1,结果calpain m RNA相对表达量为:Calpain-2 si RNA组为0.64±0.08,random-sequence si RNA组为1.02±0.24;蛋白水平calpain-2 si RNA组calpain-2/GAPDH比值仅为0.48±0.07,而random-sequence si RNA组calpain-2/GAPDH比值为1.15±0.16;统计学分析表明:calpain-2 si RNA组与正常PC12细胞组相比差异均有统计学意义(P均<0.05)。random-sequence si RNA组和正常PC12细胞组之间的差异无统计学意义(P均>0.05),表明si RNAs下调了PC12细胞中Calpain-2基因的表达水平。(7)免疫荧光细胞方法检测发现大部分PC12细胞表达calpain-2和n NOS蛋白,且calpain-2和n NOS蛋白可以共标于同一个PC12细胞胞浆中。转染Calpain-2的si RNA和random-sequence si RNA后,行荧光定量PCR和western-blot检测n NOS m RNA和蛋白水平,将正常PC12组设为1,发现各实验组n NOS m RNA的相对表达量:calpain-2 si RNA组为0.43±0.002,random-sequence si RNA组为1.04±0.12;各实验组n NOS蛋白的相对表达量:calpain-2 si RNA组n NOS/GAPDH比值仅为0.25±0.09,而random-sequence si RNA组n NOS/GAPDH比值为1.09±0.16。统计分析显示:calpain-2 si RNA组与正常PC12细胞组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),而random-sequence si RNA组和正常PC12细胞组比较无明显差异(P>0.05)。表明下调calpain-2基因会抑制n NOS蛋白的表达。小结:本实验所用的过表达mi R-137-3p慢病毒能够稳定地导入分化的PC12细胞中并能有效上调mi R-137-3p的表达,双荧光素酶实验确定calpain-2是mi R-137-3p的靶基因,且下调calpain-2基因会抑制n NOS基因的表达。三、mi R-137-3p在神经细胞氧化应激损伤中的地位和作用机制目的:研究mi R-137-3p对于氧化应激损伤的PC12神经细胞的影响。方法:建立过氧化氢诱导PC12细胞凋亡的细胞模型,设空白对照组,正常对照组,H2O2损伤组,转染过表达mi R-137-3p慢病毒+H2O2损伤组,和转染空载病毒+H2O2损伤组。用RT-q PCR和western-blot方法检测mi R-137-3p、calpain-2和n NOS基因在损伤的PC12细胞的表达水平,用calpain活性试剂盒检测Calpain-2的酶活性,用CCK-8实验定量PC12细胞的凋亡水平。结果:(1)PC12细胞氧化损伤后RT-q PCR结果显示:将PC12组设为1,PC12+氧化损伤组中mi R-137-3p的表达下降,calpain-2的表达上升(p均<0.05)。(2)细胞活力实验:过氧化氢诱导PC12细胞氧化损伤后,结果显示:以正常对照组表达量作为100%,H2O2损伤组86.32±0.32%,转染过表达mi R-137-3p慢病毒+H2O2损伤组91.38±0.27%,转染空载病毒+H2O2损伤组86.94±1.82%;统计学分析表明:氧化损伤的三组细胞的存活率均低于正常细胞对照(p均<0.05),但是mi R-137-3p慢病毒+H2O2损伤组的细胞存活率高于H2O2损伤组和转染空载病毒+H2O2损伤组(p均<0.05),H2O2损伤组和转染空载病毒+H2O2损伤组并无显著差异(p>0.05)。(3)Calpain酶活性:与PC12细胞组(3.54±0.17 fu/mg)比,mi R-137-3p组的calpain活性明显降低(1.58±0.69 fu/mg)(p<0.05),而NC组(3.57±0.76 fu/mg)与正常PC12细胞组之间无明显差异。氧化损伤后,与正常PC细胞组相比,PC12+氧化损伤组中calpain活性明显上升(9.58±0.62 fu/mg)(p<0.05),NC+氧化损伤组同样表现出calpain活性明显上升(9.68±0.23 fu/mg)(p<0.05),且PC12+氧化损伤组与NC+氧化损伤组之间并无明显差异,然而,在mi R-137-3p+氧化损伤组中,calpain活性较mi R-137-3p组明显升高(3.30±0.64fu/mg),与PC12细胞组无明显差异,且明显低于PC12+氧化损伤组与NC+氧化损伤组(p<0.05)。(4)蛋白表达水平:将PC12组设为1,calpain-2:mi R-137-3p+氧化损伤组calpain-2/GAPDH比值仅为1.34±0.11,而PC12+氧化损伤组calpain-2/GAPDH比值为4.31±0.76,NC+氧化损伤组calpain-2/GAPDH比值为3.85±0.65。n NOS:mi R-137-3p+氧化损伤组n NOS/GAPDH比值仅为1.24±0.42,而PC12+氧化损伤组n NOS/GAPDH比值为2.80±0.69,NC+氧化损伤组n NOS/GAPDH比值为2.65±0.29。mi R-137-3p+氧化损伤组与PC12+氧化损伤组和NC+氧化损伤组相比,calpain-2和n NOS蛋白表达明显降低(P均<0.05),而PC12+氧化损伤组和NC+氧化损伤组比较无明显差异(P>0.05)。小结:本实验中先应用H2O2作用于PC12细胞模拟氧化应激状态,制作细胞凋亡模型。发现在H2O2诱导PC12细胞凋亡中,mi R-137-3p表达下降而calpain-2和n NOS表达上升,过表达mi R-137-3p后,通过抑制calpain-2和n NOS的表达可以对凋亡细胞起保护作用。四、mi R-137-3p在臂丛根性撕脱伤运动神经元凋亡进程中的地位和作用机制目的:研究mi R-137-3p在臂丛根性撕脱伤运动神经元凋亡中的作用和机制。方法:建立成年大鼠单侧C7根性撕脱模型,并在损伤后1周微注射GFP标记的mi R-137-3p慢病毒至损伤侧脊髓前角,设立假手术组,单纯撕脱组,撕脱+给予mi R-137-3p慢病毒组和撕脱+给予空载慢病毒对照组。撕脱伤后2周应用calpain-2和n NOS抗体免疫荧光检测成年大鼠脊髓内mi R-137-3p慢病毒对calpain-2和n NOS的调控作用;取损侧C7脊髓和正常大鼠脊髓进行对比,RT-q PCR检测mi R-137-3p m RNA的变化,western检测calpain-2蛋白的表达变化,撕脱伤后2周和4周应用乙酰胆碱转移酶(Ch AT)检测成年大鼠脊髓前角运动神经元对慢病毒的摄取以及慢病毒在运动神经元内的分布特征;应用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶(NADPH-d)组织化学反应加中性红复染检测损伤侧脊髓前角n NOS阳性神经元和存活运动神经元数目的变化。结果:(1)mi R-137-3p慢病毒注射脊髓后,撕脱伤2周和4周后免疫荧光检测发现大部分损伤脊髓前角运动神经元的胞浆内转染了GFP绿色荧光标记的mi R-137-3p慢病毒,且撕脱伤后4周仍可在运动神经元的胞浆内检测到这些GFP阳性的mi R-137-3p慢病毒。而且这些GFP阳性的运动神经元与红色荧光标记的Ch AT共标。另外,在注射部位周围的胶质细胞中也可以发现散在的GFP阳性细胞。(2)损伤后2周取损侧脊髓定量分析mi R-137-3p m RNA水平:以正常脊髓组织作为1,撕脱伤组(Av)0.49±0.05,撕脱伤以及过表达mi R-137-3p慢病毒组(Av+mi R-137-3p)为6.09±0.86,撕脱伤以及空载病毒组(Av+ns NC)为0.34±0.08。统计学分析表明mi R-137-3p慢病毒组mi R-137-3p表达水平明显上升,与Av组相比,差异有显著的统计学意义(p<0.05),而NC组与Av组相比差异无统计学意义(P>0.05)。(3)Western-blot结果显示:将正常脊髓组Calpain-2/GAPDH比值设为1,mi R-137-3p慢病毒组仅为0.44±0.14,Av组为4.46±0.20,NC组为4.91±1.04。mi R-137-3p慢病毒组与Av组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),而NC组和Av组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(4)以臂丛根性撕脱伤脊髓C7节段健侧中性红阳性的运动神经元数目为分母,计数损伤侧C7节段前角n NOS阳性运动神经元数:在2周时间点:Av组为47.83%±3.13%,Av+mi R-137-3p慢病毒组为18.78%±6.37%,Av+NC组为44.28%±13.14%;4周时间点:Av组为13.21%±2.60%,Av+mi R-137-3p慢病毒组为19.51%±5.71%,Av+NC组为17.81%±2.92%。统计分析显示:损伤2周时,Av+mi R-137-3p慢病毒组n NOS阳性神经元的数目明显下降,与Av组相比,差异有显著意义(p<0.05),而Av+NC组与Av组差异无统计学意义(P>0.05),损伤4周时,三组之间无明显差异(p>0.05).(5)各组动物脊髓C7节段前角运动神经元存活率:术后2周时间点,Av组为66.90%±1.08%,Av+mi R-137-3p慢病毒组为86.07%±3.56%,Av+NC组为65.67%±6.63%;术后4周时间点,Av组为49.13%±16.26%,Av+mi R-137-3p慢病毒组为78.04%±7.14%,Av+NC组为56.12%±3.33%。统计学分析显示:术后2周和4周的变化一致,Av+mi R-137-3p慢病毒组存活神经元数量均高于Av组(p<0.05),而Av组和Av+NC组的差异无统计学意义(p>0.05)。小结:在臂丛根性撕脱伤成年大鼠模型中,验证了脊髓微注射给予慢病毒能成功被损伤运动神经元摄取至胞体,并且可以持续表达;慢病毒能成功上调损伤运动神经元的mi R-137-3p表达水平,且mi R-137-3p上调导致其靶基因calpain-2蛋白水平的降低,一致损伤运动神经元内n NOS蛋白的异位表达减少,运动神经元存活数目增多。结论1.成年大鼠臂丛根性撕脱伤诱导脊髓内在mi RNAs出现差异表达的mi RNAs,且这些差异表达的mi RNAs表达具有时空特异性。其中mi R-137-3p在撕脱伤后2周表达下降-。预测靶基因calpain2在撕脱伤运动神经元中表达增加。2.体外培养的神经细胞模型中验证了mi R-137-3p的靶基因Capn2,且下调Calpain-2基因的表达能抑制神经细胞中n NOS蛋白的表达水平。3.确定了mi R-137-3p-calpain-2-n NOS通路在H2O2诱导PC12细胞凋亡中的作用机制,上调mi R-137-3p能减少神经细胞的过氧化损伤。4.确定了脊髓内定位微注射mi R-137-3p慢病毒载体,能转染外源性mi R-137-3p入活体动物损伤的运动神经元胞体且持续作用3周,达到上调mi R-137-3p表达水平的效果。5.确定了mi R-137-3p-calpain-2-n NOS通路在臂丛根性撕脱伤运动神经元凋亡中的作用机制,上调mi R-137-3p能减少撕脱伤运动神经元的凋亡。为以mi R-137-3p-calpain-2-n NOS为分子靶标,治疗运动神经元疾病提供了新的研究思路。